Exossomos: o que são, como se diferenciam das vesículas extracelulares e como são caracterizados

Exossomos são vesículas extracelulares de origem endossomal, liberadas pela célula quando um corpo multivesicular se funde com a membrana plasmática, e que carregam proteínas, lipídios e material genético entre células. Seu diâmetro é geralmente inferior a 200 nm. Segundo a International Society for Extracellular Vesicles (ISEV), sociedade que estabelece o consenso metodológico da área, exossomos representam um subtipo das vesículas extracelulares, e não um sinônimo delas.

Essa distinção deixou de ser detalhe terminológico. Em 2024 a ISEV publicou a terceira iteração de suas diretrizes, o MISEV2023, documento construído com contribuição de mais de mil pesquisadores, que recomenda expressamente cautela no uso do termo exossomo e orienta o emprego do termo genérico vesícula extracelular quando a origem subcelular das partículas não pode ser demonstrada. O documento também formaliza a existência das partículas extracelulares não vesiculares, abundantes em praticamente toda preparação de exossomos.

Esta página reúne o essencial sobre o termo:

o que são exossomos e como são formados;
por que o consenso da área recomenda o termo vesícula extracelular;
o que são partículas extracelulares não vesiculares e por que interferem;
quais métodos separam exossomos de amostras biológicas;
quais técnicas caracterizam essas partículas e o que cada uma mede;
aplicações em pesquisa e limitações atuais do campo.

O que são exossomos

Os exossomos originam-se do sistema endossomal. Vesículas intraluminais formam-se por invaginação da membrana de endossomos tardios, dando origem ao corpo multivesicular. Quando esse corpo se funde com a membrana plasmática, as vesículas intraluminais são liberadas para o meio extracelular como exossomos.

São delimitados por uma bicamada lipídica e transportam uma carga biologicamente ativa que inclui proteínas de superfície e citosólicas, RNA mensageiro, microRNA, lipídios e metabólitos. As tetraspaninas CD9, CD63 e CD81 estão entre as proteínas mais frequentemente associadas a essas partículas e são usadas como marcadores positivos em protocolos de caracterização.

A composição de um exossomo reflete parcialmente o estado da célula de origem, o que explica o interesse do campo por essas partículas como fonte de biomarcadores e como mediadoras de comunicação intercelular.

Exossomo ou vesícula extracelular: o que o consenso recomenda

O MISEV2023 define vesículas extracelulares como partículas liberadas por células, delimitadas por uma bicamada lipídica, e incapazes de se replicar por si mesmas. A partir dessa definição, o documento estabelece que termos ligados à biogênese, como exossomo e ectossomo, devem ser evitados a menos que a origem subcelular seja demonstrada para aquela fonte e condição específicas.

A razão é metodológica. A maioria das técnicas de separação não enriquece populações produzidas por mecanismos distintos, e não existem marcadores moleculares universais capazes de identificar exossomos, ectossomos ou qualquer outro subtipo de forma inequívoca.

Pequenas vesículas extracelulares e exossomos não são sinônimos. A população de pequenas vesículas inclui tanto exossomos, de origem endossomal, quanto ectossomos pequenos, originados da membrana plasmática.

Os termos operacionais pequenas vesículas extracelulares e grandes vesículas extracelulares são recomendados no lugar dos termos de biogênese. Embora pequenas vesículas sejam frequentemente descritas como partículas abaixo de 200 nm de diâmetro, o próprio documento registra que não existe consenso estrito sobre os cortes superior e inferior, e que o diâmetro medido depende do método de caracterização empregado.

Na prática, isso significa que a vasta literatura existente sobre exossomos descreve, na maior parte dos casos, populações amplas de vesículas extracelulares.

Partículas extracelulares não vesiculares

O MISEV2023 propõe o termo partículas extracelulares como guarda-chuva para montagens multimoleculares derivadas de células na faixa de nanômetros a mícrons, abrangendo entidades vesiculares e não vesiculares. As partículas extracelulares não vesiculares são aquelas cujos lipídios, quando presentes, não formam uma membrana delimitante.

Lipoproteínas, partículas ribonucleoproteicas e agregados proteicos entram nessa categoria. Elas podem ter propriedades físico-químicas sobrepostas às das vesículas e podem superá-las numericamente de forma expressiva em matrizes biológicas. A consequência é direta: a maioria dos métodos de separação resulta em coisolamento dessas partículas junto às vesículas.

Como os exossomos são separados de amostras biológicas

A separação é a etapa que mais influencia a qualidade de tudo o que vem depois. Cada método explora uma propriedade física ou bioquímica diferente e apresenta um compromisso próprio entre rendimento e especificidade.

Ultracentrifugação diferencial: aplica forças centrífugas crescentes para sedimentar partículas de coeficientes de sedimentação decrescentes. Coisola partículas não vesiculares de coeficiente semelhante, especialmente em velocidades altas e tempos longos.
Gradiente e almofada de densidade: separa classes de partículas por densidade característica. Entrega material de alta pureza com recuperação relativamente baixa.
Cromatografia de exclusão por tamanho: a SEC separa partículas de tamanho de vesícula das partículas não vesiculares pequenas e proteínas livres. Opera de forma suave e dilui a amostra.
Captura por afinidade: a captura por imunoafinidade recupera partículas que expõem um determinante molecular específico. Seleciona subtipos, não a população total.
Precipitação com polímeros: concentra todas as partículas extracelulares presentes, incluindo proteínas livres. O MISEV2023 desencoraja fortemente seu uso, exceto para redução de volume.

Como nem a separação por tamanho nem a por densidade consegue remover todas as lipoproteínas, o documento recomenda a combinação de métodos que exploram propriedades distintas quando populações mais puras são necessárias. O isolamento automatizado por SEC responde à parte dessa exigência ao padronizar a etapa mais sensível do preparo.

Como os exossomos são caracterizados

Caracterizar exossomos envolve estimar quantidade, estabelecer a presença de vesículas e avaliar a contribuição de componentes não vesiculares à preparação. Cada técnica enxerga a amostra por um princípio físico distinto:

Rastreamento de nanopartículas: a NTA mede diâmetro hidrodinâmico e concentração partícula a partícula, por espalhamento de luz.
NTA em fluorescência: restringe a contagem a partículas que emitem sinal após marcação, diferenciando estruturas membranosas de agregados.
Espalhamento dinâmico de luz: entrega distribuição de tamanho em análise de conjunto, não de partícula única.
Pulso resistivo e microfluídica: medem tamanho e concentração por variação de corrente elétrica na passagem por um poro.
Citometria de fluxo e nano-flow: permitem fenotipagem por marcador em partícula única, com limite de detecção dependente da calibração.
Microscopia eletrônica: a TEM fornece informação morfológica e confirma a presença de estrutura de membrana.
Métodos imunológicos: o Western blot detecta marcadores positivos de vesícula e marcadores negativos de contaminantes.

Nenhuma medição ou método isolado satisfaz todos os requisitos de caracterização de vesículas extracelulares. O MISEV2023 recomenda o uso de métodos ortogonais, aqueles que não compartilham as mesmas limitações de medição.

Há uma consequência de linguagem que decorre disso. Técnicas de espalhamento não distinguem vesículas de outras partículas que espalhem luz. Por isso o MISEV2023 recomenda que, quando a técnica não é específica para vesículas, o resultado seja reportado como concentração de partículas e não como concentração de vesículas extracelulares, independentemente das etapas de separação anteriores. A mesma regra vale para diâmetro.

Aplicações dos exossomos em pesquisa

O interesse do campo concentra-se em descoberta de biomarcadores, proteômica e espectrometria de massas, análise de RNA, ensaios funcionais de captação celular e desenvolvimento de sistemas de entrega de fármacos. Amostras estudadas incluem soro, plasma, urina, líquido cefalorraquidiano, leite, sobrenadante de cultura celular e culturas bacterianas.

Existe também um mercado de produtos cosméticos e estéticos contendo material descrito como exossomos, sujeito a regras regulatórias próprias em cada país. Equipamentos e reagentes destinados à pesquisa com vesículas extracelulares são classificados para uso exclusivo em pesquisa, o que exclui aplicação diagnóstica ou terapêutica.

Limitações e desafios atuais

Três limitações estruturam o estado atual do campo. Não existe marcador genérico conhecido capaz de identificar todas as vesículas extracelulares independentemente da fonte. Não existe método padrão-ouro reconhecido de isolamento, e a escolha depende do objetivo de cada grupo. E boa parte das técnicas de caracterização opera próxima aos próprios limites de detecção, o que torna o relato desses limites parte da interpretação do dado.

Há ainda uma revisão conceitual em curso. Desde a iteração anterior das diretrizes, cresceu o reconhecimento de que algumas moléculas que coisolam com as vesículas, incluindo proteínas, lipídios e mesmo lipoproteínas, podem constituir uma corona dinâmica adsorvida à superfície, capaz de servir como biomarcador ou de contribuir para a função da partícula. Estudos em andamento sobre essa corona podem alterar o que o campo considera contaminante e a necessidade percebida de preparações altamente puras.

Perguntas frequentes sobre exossomos

Qual é o tamanho de um exossomo?

Geralmente abaixo de 200 nm de diâmetro, faixa compatível com o tamanho das vesículas intraluminais dos endossomos. Valores mais restritos aparecem na literatura e em especificações de equipamentos, mas o diâmetro medido depende do método de caracterização utilizado.

Qual a diferença entre exossomo e vesícula extracelular?

Vesícula extracelular é o termo genérico para toda partícula liberada por células, delimitada por bicamada lipídica e incapaz de se replicar. Exossomo designa especificamente as vesículas de origem endossomal, liberadas via corpo multivesicular. Todo exossomo é uma vesícula extracelular, mas não o contrário.

Por que o uso do termo exossomo é desencorajado?

Porque demonstrar a origem endossomal de uma população isolada é difícil na prática. A maioria dos métodos de separação não distingue vias de biogênese e não há marcador molecular universal para esse subtipo. Sem essa demonstração, o material estudado é uma população ampla de vesículas extracelulares.

Qual a diferença entre exossomo e lipossomo?

O exossomo é produzido por células vivas e tem composição de membrana e carga molecular herdadas da célula de origem. O lipossomo é sintetizado em laboratório a partir de componentes moleculares definidos. Estruturas sintéticas desse tipo não devem ser descritas como semelhantes a exossomos, já que a expressão implica propriedades ligadas a uma via de biogênese específica.

Como se mede a concentração de exossomos?

Por técnicas de partícula única como rastreamento de nanopartículas, pulso resistivo e citometria de fluxo, ou por estimativas indiretas de proteína e lipídio total. Como técnicas de espalhamento não são específicas para vesículas, o resultado é uma concentração de partículas, e ganha confiabilidade quando confirmada por métodos ortogonais.

Quais marcadores identificam exossomos?

As diretrizes organizam os marcadores em categorias: proteínas transmembrana ou ancoradas por GPI, como as tetraspaninas CD9, CD63 e CD81; proteínas citosólicas recuperadas nas vesículas, como TSG101 e flotilinas; e uma terceira categoria de contaminantes comumente coisolados, usada para avaliar pureza. Nem todas as vesículas exibem tetraspaninas, portanto o enriquecimento por esses marcadores não captura a população total.

É possível congelar exossomos?

O armazenamento prolongado é comumente feito a temperaturas de aproximadamente -80 °C. As vesículas são sensíveis a ciclos de congelamento e descongelamento e à adesão em superfícies plásticas, fatores que reduzem recuperação e comparabilidade. Recomenda-se minimizar esses ciclos por estratégia de aliquotagem e reportar integralmente as condições de armazenamento.

Exossomos podem ser usados em diagnóstico?

Equipamentos e reagentes para separação e caracterização de vesículas extracelulares são classificados para uso exclusivo em pesquisa. Aplicações diagnósticas dependem de validação e aprovação regulatória próprias.