Coisolamento: o que é, causas e impacto na pureza de vesículas extracelulares

Coisolamento é a recuperação não intencional de componentes indesejados junto com o material de interesse durante um processo de separação ou purificação. No estudo de vesículas extracelulares (EVs), o termo descreve a presença, na mesma fração, de partículas ou moléculas que não são EVs, como proteínas solúveis, agregados proteicos, lipoproteínas, partículas virais, fragmentos de membrana e outros componentes da matriz biológica.

Isso acontece porque os métodos de isolamento não reconhecem uma vesícula individualmente em todos os casos. Eles separam as partículas por uma ou mais propriedades físicas ou bioquímicas, como tamanho, densidade, carga superficial ou marcadores de membrana. Quando contaminantes compartilham essas propriedades, eles podem ser recuperados junto com as EVs. As diretrizes MISEV2023, da International Society for Extracellular Vesicles, reforçam a importância de caracterizar tanto os marcadores associados às EVs quanto os componentes não vesiculares potencialmente presentes na preparação.

Ao longo deste glossário, você vai encontrar os seguintes tópicos:

• O que significa coisolamento
• Por que o coisolamento ocorre
• Principais contaminantes em preparações de EVs
• Relação entre coisolamento, rendimento e pureza
• Coisolamento em diferentes métodos de isolamento
• Como identificar contaminantes
• Como reduzir o coisolamento
• Perguntas frequentes (FAQ)

O que é coisolamento?

Em termos simples, coisolamento é quando o método utilizado para recuperar uma partícula-alvo também recupera outras partículas ou moléculas com características parecidas. A palavra não significa necessariamente falha do procedimento: ela descreve uma limitação inerente à complexidade da amostra e à seletividade do método escolhido.

No caso das vesículas extracelulares, o desafio é especialmente relevante em biofluidos como plasma e soro. Esses materiais contêm uma grande quantidade de proteínas livres e lipoproteínas, muitas delas em faixas de tamanho ou densidade que podem se sobrepor às das EVs. Um estudo publicado no PMC (NIH) destaca que separar EVs de proteínas livres e lipoproteínas é difícil justamente pela sobreposição de propriedades físicas entre essas populações.

Por que o coisolamento ocorre?

Todo método de separação trabalha a partir de um critério. A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), por exemplo, separa principalmente pelo raio hidrodinâmico. A ultracentrifugação explora diferenças de sedimentação e densidade. Já métodos de afinidade usam interações entre marcadores e ligantes específicos.

O coisolamento ocorre quando um contaminante atende ao mesmo critério de separação da partícula desejada. Uma lipoproteína de tamanho semelhante a uma EV pode aparecer na mesma fração de uma SEC. Um agregado proteico pode sedimentar junto com vesículas durante a ultracentrifugação. Da mesma forma, uma captura por afinidade pode recuperar partículas que expressem ou adsorvam o marcador selecionado.

Portanto, a escolha do método deve considerar não apenas o tipo de EV procurado, mas também a matriz inicial, o volume de amostra, a finalidade do estudo e os contaminantes mais prováveis.

Principais contaminantes coisolados com vesículas extracelulares

A natureza do coisolamento varia conforme a amostra. Em plasma e soro, as lipoproteínas estão entre os principais desafios. Quilomícrons, VLDL, LDL e HDL podem apresentar sobreposição parcial de tamanho, densidade ou composição com subpopulações de EVs. Em meio de cultura celular, proteínas séricas, componentes do suplemento e partículas derivadas do soro fetal bovino podem afetar a preparação.

• Proteínas livres: albumina e outras proteínas abundantes da matriz.
• Agregados proteicos: estruturas formadas por associação de proteínas que podem se comportar como partículas.
• Lipoproteínas: especialmente relevantes em plasma e soro, por sua alta abundância e sobreposição física com EVs.
• Fragmentos celulares: restos de membrana, corpos apoptóticos e partículas geradas por lise celular.
• Partículas não vesiculares: vírus, complexos ribonucleoproteicos e outros nanocomponentes presentes na amostra.

Uma revisão disponível no PMC (NIH) observa que a SEC pode remover parte das proteínas pequenas, mas tem dificuldade em separar completamente lipoproteínas que apresentam tamanhos sobrepostos aos das EVs.

Coisolamento, rendimento e pureza: qual é a diferença?

Rendimento, pureza e coisolamento são conceitos relacionados, mas não são sinônimos. O rendimento indica quanto material ou quantas partículas foram recuperadas. A pureza indica a proporção entre o material de interesse e os componentes não desejados. Já o coisolamento descreve o mecanismo ou o resultado da recuperação conjunta desses componentes.

Um protocolo com rendimento elevado pode recuperar muitas EVs, mas também muitas proteínas ou lipoproteínas. Nesse cenário, a concentração de partículas isoladamente não prova que a amostra seja mais pura. Técnicas como NTA, por exemplo, quantificam e analisam partículas, mas não distinguem por si só EVs de lipoproteínas de tamanho semelhante.

Coisolamento em diferentes métodos de isolamento

O risco de coisolamento existe em diferentes estratégias, mas muda de forma conforme o princípio empregado.

• Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC): preserva bem as EVs e reduz parte das proteínas solúveis, mas pode co-isolar partículas de tamanho semelhante, como algumas lipoproteínas.
• Ultracentrifugação diferencial: é amplamente utilizada, porém pode concentrar proteínas, agregados e partículas com comportamento de sedimentação próximo ao das EVs.
• Precipitação polimérica: tende a apresentar bom rendimento, mas pode recuperar proteínas, polímeros residuais e outras partículas presentes na matriz.
• Ultrafiltração: depende do corte de tamanho da membrana e pode concentrar simultaneamente EVs e macromoléculas retidas.
• Captura por afinidade: pode aumentar a seletividade para subpopulações específicas, mas seu desempenho depende do marcador escolhido e da especificidade da interação.

Não existe um método universalmente ideal. Muitas aplicações exigem combinar técnicas, como pré-processamento da amostra seguido de SEC, ultrafiltração ou afinidade, equilibrando rendimento, pureza, tempo e escalabilidade.

Como identificar o coisolamento?

A identificação não deve depender de uma única medição. A recomendação é combinar métodos complementares para confirmar a presença de EVs e investigar contaminantes. As diretrizes MISEV2023 recomendam relatar marcadores de componentes associados a EVs e de componentes não vesiculares quando aplicável.

• Marcadores de EVs: proteínas como CD9, CD63 e CD81 podem apoiar a identificação de populações enriquecidas em pequenas EVs.
• Marcadores de contaminantes: albumina e apolipoproteínas, como ApoA1 ou ApoB, ajudam a investigar proteínas livres e lipoproteínas em amostras sanguíneas.
• Western blot ou imunodosagens: permitem comparar a distribuição de marcadores entre frações.
• NTA: auxilia na avaliação de concentração e distribuição de tamanho, mas não identifica sozinho a origem das partículas.
• Microscopia eletrônica: pode contribuir para avaliar morfologia e heterogeneidade da preparação.

Em uma análise de plasma publicada no PMC (NIH), os autores concluíram que a SEC isoladamente não separa completamente as EVs plasmáticas das partículas de lipoproteína. Esse tipo de evidência reforça a necessidade de analisar as frações de acordo com a matriz estudada.

Como reduzir o coisolamento?

Reduzir o coisolamento começa antes da etapa de isolamento. Um pré-processamento adequado pode diminuir células, detritos e partículas maiores. A seleção de uma técnica compatível com a matriz também é decisiva: plasma, soro, urina, sobrenadante de cultura e outros biofluidos apresentam desafios diferentes.

• Padronizar a coleta, o armazenamento e o pré-processamento da amostra.
• Selecionar o método de isolamento conforme a matriz e o objetivo analítico.
• Controlar o volume de carga e coletar frações de forma consistente.
• Combinar métodos de separação quando a aplicação exigir maior pureza.
• Caracterizar EVs e contaminantes em vez de inferir pureza apenas pela contagem de partículas.
• Reportar limitações e marcadores de coisolamento no estudo ou no controle de qualidade.

Em fluxos automatizados de isolamento por SEC, a padronização dos volumes, das frações e dos programas ajuda a reduzir a variabilidade operacional. Ainda assim, a automação não elimina por si só o coisolamento inerente à composição e à sobreposição de propriedades das partículas na amostra.

Perguntas frequentes sobre coisolamento

O que é coisolamento?

É a recuperação não intencional de contaminantes junto com o material de interesse durante uma etapa de isolamento ou purificação.

Coisolamento e contaminação são a mesma coisa?

São termos relacionados, mas o coisolamento descreve especificamente quando componentes da própria amostra são recuperados junto com o alvo por compartilharem propriedades físicas ou bioquímicas.

A SEC elimina todo o coisolamento?

Não. A SEC reduz parte dos contaminantes solúveis, mas partículas de tamanho semelhante às EVs, como algumas lipoproteínas, podem permanecer nas mesmas frações.

NTA identifica coisolamento?

Não de forma conclusiva. A NTA mede partículas e sua distribuição de tamanho, mas não diferencia sozinha EVs de outras nanopartículas com dimensões semelhantes.

Por que o coisolamento é importante em plasma e soro?

Porque esses biofluidos possuem proteínas e lipoproteínas muito abundantes, algumas com tamanho e densidade que se sobrepõem aos das vesículas extracelulares.

Como avaliar a pureza de uma preparação de EVs?

Com métodos complementares, combinando análise de partículas, marcadores de EVs, marcadores de contaminantes e, quando aplicável, avaliação morfológica.

É possível eliminar completamente o coisolamento?

Em muitas matrizes complexas, o objetivo prático é reduzir e quantificar o coisolamento de forma adequada à aplicação, pois a eliminação completa pode comprometer rendimento ou representatividade da população de EVs.

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