VLDL, do inglês Very Low-Density Lipoprotein, é uma lipoproteína produzida principalmente pelo fígado para transportar triglicerídeos endógenos pela circulação. Para pesquisadores de vesículas extracelulares, entretanto, VLDL tem uma segunda importância: suas dimensões podem se sobrepor às de pequenas EVs, fazendo com que essas partículas coisolem e sejam detectadas conjuntamente em amostras derivadas de plasma e soro.

Essa sobreposição transforma VLDL em um dos principais interferentes na análise de EVs circulantes. Técnicas de separação por tamanho, contagem de nanopartículas, espalhamento de luz e marcação lipofílica podem registrar componentes provenientes de VLDL sem necessariamente distingui-los das vesículas de interesse.

Portanto, compreender VLDL em pesquisa de EVs exige separar duas questões diferentes: VLDL-C, utilizado em exames clínicos para expressar colesterol associado à VLDL, e partículas VLDL, que constituem uma população de nanopartículas biológicas capaz de interferir diretamente no isolamento e na caracterização de vesículas extracelulares.

VLDL: o que é?

VLDL significa Very Low-Density Lipoprotein, ou lipoproteína de muito baixa densidade. Essas partículas são produzidas principalmente pelo fígado e participam do transporte de triglicerídeos sintetizados ou reorganizados no metabolismo hepático para tecidos periféricos.

A estrutura da VLDL é distinta da estrutura de uma vesícula extracelular. Enquanto EVs são delimitadas por uma bicamada lipídica, lipoproteínas apresentam um núcleo hidrofóbico contendo principalmente triglicerídeos e ésteres de colesterol circundado por uma monocamada de fosfolipídios, colesterol livre e apolipoproteínas.

A ApoB-100 é a principal apolipoproteína estrutural da VLDL produzida pelo fígado. À medida que triglicerídeos são removidos da partícula na circulação, ocorre uma remodelação progressiva que contribui para a formação de partículas remanescentes, IDL e posteriormente LDL.

O que é colesterol VLDL?

O termo colesterol VLDL, frequentemente abreviado como VLDL-C, não significa que VLDL seja um tipo de colesterol. VLDL é uma partícula lipoproteica que transporta diferentes lipídios; VLDL-C representa especificamente a quantidade de colesterol transportada ou associada a essa classe de partículas.

Essa distinção é importante porque um resultado clínico expresso em mg/dL mede uma concentração de colesterol, enquanto estudos de nanopartículas podem trabalhar com número de partículas por volume, distribuição de diâmetro, intensidade de espalhamento, marcadores moleculares ou concentração de ApoB. Esses parâmetros não são intercambiáveis.

Em outras palavras, uma medida de VLDL-C não informa diretamente quantas partículas VLDL existem em uma preparação de vesículas extracelulares. Duas amostras podem apresentar relações diferentes entre quantidade de lipídio transportado, tamanho das partículas e número de partículas circulantes.

VLDL colesterol: o que significa em um exame?

Em um perfil lipídico clínico, VLDL-C é utilizado como estimativa da quantidade de colesterol associada às lipoproteínas de muito baixa densidade. Como essas partículas são particularmente ricas em triglicerídeos, laboratórios frequentemente estimam VLDL-C a partir da concentração de triglicerídeos em vez de realizar uma contagem física das partículas.

Uma aproximação historicamente utilizada considera VLDL-C como aproximadamente um quinto da concentração de triglicerídeos quando os resultados são expressos em mg/dL. Essa relação possui limitações e deixa de ser adequada em determinadas condições, especialmente quando os triglicerídeos estão muito elevados.

Para pesquisa de EVs, a consequência mais importante é que VLDL-C clínico e concentração de VLDL como nanopartícula são grandezas diferentes. O valor presente no laudo não pode ser convertido diretamente no número de partículas capazes de interferir em NTA, SEC ou citometria.

Colesterol VLDL: valor normal e valor de referência

Fontes clínicas como MedlinePlus apresentam aproximadamente 2 a 30 mg/dL como intervalo comum para VLDL-C, ao mesmo tempo em que ressaltam que valores de referência podem variar entre laboratórios e métodos.

Esse número deve ser interpretado dentro do contexto clínico para o qual foi produzido. Em pesquisa de vesículas extracelulares, não existe uma equivalência direta entre estar dentro de uma faixa clínica de VLDL-C e possuir uma amostra sem interferência de lipoproteínas.

Mesmo amostras provenientes de indivíduos sem alterações importantes no perfil lipídico podem conter uma concentração de lipoproteínas muito superior à concentração de EVs. Assim, valor de referência clínico não é um critério de pureza de uma preparação de EVs.

Colesterol VLDL é bom ou ruim?

A expressão 'colesterol ruim' é uma simplificação usada em educação em saúde. Concentrações aumentadas de lipoproteínas contendo ApoB e de partículas ricas em triglicerídeos ou seus remanescentes estão relacionadas ao processo aterosclerótico, razão pela qual VLDL pode aparecer nessa categoria em materiais destinados ao público geral.

Do ponto de vista bioquímico, entretanto, VLDL desempenha uma função fisiológica de transporte lipídico. Para pesquisadores de EVs, classificá-la como 'boa' ou 'ruim' não ajuda a responder a principal pergunta analítica.

Nesse contexto, a questão correta é: a VLDL presente na amostra pode ser separada das EVs com a resolução necessária para o experimento?

Por que VLDL é um interferente importante na análise de vesículas extracelulares?

Plasma e soro não contêm somente vesículas extracelulares. São matrizes extremamente complexas, com proteínas solúveis, agregados proteicos, plaquetas residuais e grandes populações de lipoproteínas. A MISEV2023 identifica HDL, LDL, IDL, VLDL e quilomícrons entre os principais componentes capazes de permanecer em preparações de EVs derivadas de sangue.

O problema é quantitativo e físico. Algumas classes de lipoproteínas estão presentes em concentrações muito superiores às de EVs e apresentam sobreposição de propriedades como tamanho, densidade ou composição molecular. Consequentemente, mesmo uma pequena proporção residual pode exercer grande influência sobre determinados ensaios.

Isso é particularmente crítico quando a conclusão experimental depende de concentração de partículas, conteúdo de lipídios, proteínas, RNA, fluorescência ou atividade biológica. Um componente atribuído às EVs pode, na realidade, estar presente em lipoproteínas coisoladas ou associado a complexos EV-lipoproteína.

VLDL e vesículas extracelulares podem ter o mesmo tamanho?

Existe sobreposição significativa. Faixas frequentemente citadas para VLDL ficam aproximadamente entre 30 e 80 nm, embora estudos empregando diferentes métodos e classificações de subpopulações relatem distribuições mais amplas. Pequenas vesículas extracelulares, por sua vez, ocupam amplamente a escala nanométrica e uma parcela relevante pode estar justamente nessa região.

Essa sobreposição é uma das razões pelas quais tamanho isoladamente não identifica uma partícula. Uma partícula de 70 nm detectada em plasma pode ser compatível com uma pequena EV, mas também com uma VLDL ou outra nanopartícula presente na matriz.

A MISEV2023 recomenda inclusive que resultados baseados somente em técnicas de partículas sejam descritos como partículas ou partículas extracelulares quando não houver evidência suficiente para atribuir identidade específica de EV.

VLDL e EV são estruturalmente diferentes apesar da sobreposição de tamanho

A semelhança dimensional não significa equivalência estrutural. Vesículas extracelulares são estruturas delimitadas por bicamada lipídica e podem carregar proteínas transmembrana, proteínas citosólicas, lipídios e ácidos nucleicos associados à célula de origem.

VLDL apresenta organização diferente: um núcleo rico em lipídios neutros é recoberto por uma monocamada contendo fosfolipídios, colesterol e apolipoproteínas. A ApoB-100 constitui um componente estrutural particularmente importante dessa classe.

Essa diferença cria possibilidades de caracterização ortogonal. Marcadores proteicos associados a EVs e apolipoproteínas podem ser analisados em conjunto para avaliar o enriquecimento relativo entre a população de interesse e os coisolados.

SEC consegue separar VLDL de vesículas extracelulares?

A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) é muito eficiente para separar EVs de diversos componentes menores, especialmente proteínas solúveis. O princípio utiliza diferenças de volume hidrodinâmico: partículas maiores acessam menos os poros da matriz e tendem a eluir mais cedo.

O desafio aparece quando duas populações possuem dimensões semelhantes. Como uma parcela das VLDL está na mesma região de tamanho que pequenas EVs, ambas podem atravessar a coluna com comportamentos de retenção próximos e aparecer nas mesmas frações.

Por isso, SEC não deve ser descrita como um método que necessariamente remove toda a VLDL. A MISEV2023 é explícita ao indicar que nem separação somente por tamanho nem somente por densidade é capaz de separar todas as classes de lipoproteínas das EVs.

Por que SEC remove proteínas melhor do que VLDL?

Albumina, imunoglobulinas e muitas outras proteínas solúveis possuem dimensões hidrodinâmicas muito menores do que pequenas vesículas extracelulares. Essa diferença produz uma janela de separação favorável: EVs eluem em frações iniciais enquanto grande parte das proteínas penetra mais profundamente na matriz e aparece posteriormente.

VLDL representa um problema diferente. Como é uma nanopartícula e não uma pequena proteína solúvel, sua dimensão pode se aproximar da dimensão das EVs. Nesse caso, a seletividade fornecida exclusivamente por tamanho diminui.

Essa diferença explica por que uma preparação pode apresentar boa relação partícula/proteína total e ainda conter lipoproteínas. Baixa concentração de proteína solúvel não demonstra, por si só, ausência de VLDL.

Como VLDL interfere em NTA?

Nanoparticle Tracking Analysis determina movimento browniano de partículas detectáveis individualmente e utiliza essa informação para calcular diâmetro hidrodinâmico e concentração. O método não possui, em sua modalidade convencional, informação molecular suficiente para afirmar se cada evento corresponde a uma EV.

Assim, lipoproteínas dentro da janela de detecção podem contribuir para a concentração total observada. A MISEV2023 recomenda cautela ao interpretar NTA de biofluidos complexos justamente porque lipoproteínas e agregados proteicos podem ser contabilizados juntamente com EVs.

Consequentemente, um aumento na concentração medida por NTA após isolamento de plasma não necessariamente representa aumento equivalente no número de vesículas extracelulares. A composição das partículas recuperadas também precisa ser investigada.

Fluorescência resolve o problema de VLDL?

Depende do marcador utilizado. A fluorescência pode aumentar a especificidade quando uma partícula é detectada por meio de um marcador molecular associado à população de EVs de interesse, mas a simples utilização de um corante lipofílico não resolve automaticamente o problema.

Corantes que se inserem em estruturas lipídicas não reconhecem a origem biológica da partícula. Lipoproteínas também possuem regiões lipídicas capazes de interagir com essas sondas. A MISEV2023 ressalta especificamente que especificidade por lipídios não significa especificidade por EVs.

Portanto, combinar detecção física com marcadores mais específicos pode fornecer informação substancialmente mais robusta do que utilizar somente tamanho ou fluorescência lipídica.

DiI também pode marcar VLDL?

Sim. DiI é uma sonda lipofílica e pode se associar tanto a membranas de vesículas quanto a lipoproteínas. Estudos experimentais demonstraram marcação fluorescente de VLDL por DiI, tornando essa interação especialmente importante em trabalhos com EVs derivadas de sangue.

Esse comportamento cria um problema de interpretação: uma partícula fluorescente detectada depois de uma etapa de marcação lipídica não pode ser automaticamente classificada como vesícula extracelular.

A situação torna-se ainda mais complexa porque corantes lipofílicos também podem formar agregados ou outras estruturas fluorescentes. Controles contendo somente corante, amostras não marcadas e marcadores moleculares adicionais são, portanto, fundamentais.

Como VLDL pode interferir em estudos de uptake de vesículas extracelulares?

Se uma preparação contém simultaneamente EVs e VLDL e ambas incorporam um marcador lipofílico, a fluorescência detectada após exposição celular pode ter múltiplas origens. Ela pode resultar de EVs, lipoproteínas, complexos entre ambas ou transferência do próprio corante.

Consequentemente, observar fluorescência intracelular não demonstra isoladamente internalização de EVs intactas. Esse princípio é particularmente importante em estudos de biodistribuição e trafficking nos quais a interpretação depende de saber qual estrutura transportou efetivamente o marcador.

Quanto mais complexa a matriz inicial, maior a necessidade de controles que acompanhem identidade molecular além da simples presença de uma sonda lipofílica.

VLDL pode estar fisicamente associada a vesículas extracelulares?

A relação entre EVs e lipoproteínas não precisa ser limitada à ideia de 'contaminação independente'. Evidências experimentais indicam que lipoproteínas podem interagir com superfícies de EVs e participar da chamada corona biomolecular que se estabelece quando nanopartículas entram em contato com ambientes biológicos complexos.

Isso introduz uma dificuldade conceitual importante. Uma ApoB detectada em uma preparação pode representar uma lipoproteína livre coisolada, mas determinados componentes lipoproteicos também podem estar associados às superfícies das EVs.

Por esse motivo, procedimentos de purificação muito agressivos também podem modificar a interface biológica que se pretende estudar. A estratégia de isolamento deve ser compatível com a pergunta experimental, e não apenas buscar a menor quantidade possível de qualquer componente não vesicular.

Como avaliar contaminação por VLDL em preparações de EVs?

Não existe uma única medida suficiente. Uma abordagem tecnicamente mais robusta combina caracterização das partículas de interesse com avaliação dos principais componentes não vesiculares previstos para aquela matriz.

• ApoB: importante indicador de lipoproteínas contendo ApoB, incluindo VLDL, IDL e LDL.
• ApoA-I: frequentemente utilizada para avaliar lipoproteínas da classe HDL.
• Marcadores de EVs: proteínas como CD9, CD63 e CD81 podem contribuir para demonstrar enriquecimento de populações vesiculares, dependendo da amostra e da pergunta experimental.
• Concentração e tamanho de partículas: NTA, RPS ou técnicas relacionadas fornecem informação física, mas não identidade isoladamente.
• Microscopia: pode fornecer evidência morfológica complementar, embora também possua limitações de amostragem e identificação.
• Ensaios bioquímicos ou proteômicos: podem determinar a proporção relativa de componentes vesiculares e não vesiculares.

O objetivo não é apenas demonstrar presença de EVs. Para muitos estudos, é igualmente importante demonstrar o grau de enriquecimento das EVs em relação aos coisolados relevantes.

ApoB positiva significa especificamente VLDL?

Não. Essa distinção é importante. ApoB-100 está presente em diferentes partículas da via endógena de lipoproteínas, incluindo VLDL, seus remanescentes, IDL e LDL. Detectar ApoB demonstra presença de partículas contendo ApoB, mas não identifica automaticamente qual subclasse está presente.

O tamanho da população, a densidade, outras apolipoproteínas e a estratégia de fracionamento podem ajudar a fornecer contexto adicional. Em uma preparação de EVs, ApoB é particularmente útil como marcador de coisolamento lipoproteico.

Assim, resultados de Western blot ou outros ensaios devem ser descritos com precisão: redução de ApoB indica redução de material associado a lipoproteínas contendo ApoB, e não necessariamente quantificação específica de VLDL.

Por que o estado alimentado ou em jejum importa em estudos de EVs de sangue?

A composição lipoproteica do plasma muda em função da alimentação. Quilomícrons, em particular, aumentam após ingestão alimentar e constituem partículas grandes que também podem se sobrepor à distribuição de tamanho de EVs.

Por essa razão, a MISEV2023 recomenda considerar e reportar fatores pré-analíticos como alimentação, exercício, medicamentos, horário de coleta, protocolo de processamento e armazenamento. Para reduzir influência de partículas lipoproteicas grandes relacionadas à ingestão alimentar, a diretriz menciona coleta após jejum noturno.

Padronizar essas condições é especialmente importante em estudos comparativos. Caso contrário, diferenças na população de nanopartículas podem refletir condições pré-analíticas em vez de mudanças biologicamente relacionadas às EVs.

ExoFaster-600 e VLDL: o que a SEC automatizada pode e não pode demonstrar?

O ExoFaster-600, da Upper Biotech e distribuído pela Dafratec, é uma plataforma automatizada para isolamento de pequenas vesículas extracelulares utilizando cromatografia por exclusão de tamanho. O sistema é destinado à pesquisa e processa amostras como plasma, soro e sobrenadante de cultura.

Nos dados comparativos apresentados pelo fabricante, preparações obtidas pelo ExoFaster-600 apresentam marcadores de EVs como CD9 e CD63 e menor intensidade de sinais de ApoA-I e ApoB em relação à ultracentrifugação diferencial nas condições experimentais avaliadas. Esses resultados indicam menor presença detectável desses marcadores lipoproteicos naquela comparação.

Entretanto, esse resultado não deve ser traduzido como eliminação completa de VLDL. O ExoFaster-600 utiliza SEC e, portanto, permanece sujeito ao princípio físico de sobreposição entre partículas com tamanhos semelhantes. Para experimentos em que contaminação lipoproteica seja crítica, ApoB e outros controles devem continuar fazendo parte da caracterização da preparação.

Quando SEC isoladamente pode não ser suficiente?

Se o objetivo é reduzir proteínas solúveis e produzir uma preparação enriquecida em EVs para determinadas análises, SEC pode oferecer uma separação útil e reprodutível. Porém, quando a pergunta experimental exige distinguir rigorosamente EVs de lipoproteínas com dimensões semelhantes, somente tamanho pode não fornecer seletividade suficiente.

A literatura descreve estratégias que combinam propriedades ortogonais, como tamanho, densidade, carga ou afinidade molecular. Um estudo com plasma humano, por exemplo, utilizou separação baseada em densidade seguida de SEC para melhorar a separação entre EVs e lipoproteínas.

A própria MISEV2023 recomenda considerar combinações de métodos quando populações de EVs de maior pureza são necessárias, justamente porque nenhuma técnica baseada exclusivamente em tamanho ou densidade separa todas as classes de lipoproteínas.

Como VLDL pode alterar resultados de proteômica e análise de RNA de EVs?

Lipoproteínas transportam proteínas, lipídios e outras moléculas capazes de aparecer em análises downstream. Se essas partículas permanecem em uma preparação atribuída a EVs, parte do material identificado pode não possuir origem vesicular.

Isso é particularmente crítico em estudos ômicos, nos quais a elevada sensibilidade analítica permite detectar componentes presentes em quantidades muito pequenas. Apolipoproteínas abundantes também podem dominar parte do sinal proteômico e reduzir a capacidade de observar proteínas menos abundantes associadas às EVs.

Consequentemente, a pureza necessária depende da pergunta. Uma preparação adequada para contagem de partículas pode não ser adequada para atribuir proteínas ou RNA especificamente às vesículas extracelulares.

O número de partículas é suficiente para avaliar a pureza de EVs?

Não. Uma concentração elevada de partículas pode inclusive refletir coisolamento de nanopartículas não vesiculares. O mesmo vale para razões entre partículas e proteína total: elas podem fornecer informação comparativa útil, mas não identificam diretamente a natureza de cada partícula contada.

A MISEV2023 recomenda utilizar métodos complementares para demonstrar características vesiculares e avaliar componentes não vesiculares relevantes para a matriz investigada.

Em plasma e soro, isso significa considerar explicitamente lipoproteínas. Se VLDL, LDL ou outras partículas podem contribuir para o sinal obtido, a interpretação precisa incorporar essa possibilidade desde o desenho experimental.

O que um pesquisador deve definir antes de isolar EVs de plasma ou soro?

• Qual é a pergunta downstream? Contagem, fenotipagem, proteômica, RNA, ensaio funcional ou biomarcadores exigem diferentes níveis de pureza.
• Qual grau de contaminação por lipoproteínas é aceitável? A resposta depende da finalidade experimental.
• Quais propriedades serão usadas para separar? Tamanho, densidade, carga e afinidade possuem seletividades diferentes.
• Como será avaliada ApoB? A presença de lipoproteínas contendo ApoB deve ser considerada em estudos com sangue.
• Quais marcadores de EV serão utilizados? Uma única característica não define toda a população de EVs.
• Como será padronizada a coleta? Jejum, processamento, centrifugação, tempo e armazenamento podem alterar a composição da amostra.
• A técnica analítica diferencia identidade ou apenas tamanho? Essa distinção é fundamental para interpretar NTA, RPS e métodos semelhantes.

Para pesquisa de vesículas extracelulares, portanto, VLDL não é apenas um componente do perfil lipídico. É uma população de nanopartículas biologicamente abundante que pode ocupar a mesma faixa dimensional das EVs e interferir em isolamento, contagem, fluorescência e análises moleculares. Reconhecer essa sobreposição e medir os principais coisolados é parte essencial de uma interpretação experimental robusta.