A extração de vesículas extracelulares costuma envolver quatro etapas essenciais: isolar as EVs da amostra biológica, purificar o material removendo contaminantes, analisar tamanho e concentração das partículas e armazenar as vesículas para uso posterior.
Cada etapa tem exigências próprias e conta com ferramentas específicas. Sociedades como a International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) publicam diretrizes de boas práticas que percorrem justamente esse caminho, do isolamento ao relato dos dados.
Este guia apresenta para soluções dedicadas para cada uma das etapas da extração de vesículas extracelulares, com atenção especial ao preparo e à purificação da amostra.
Expectativa vs Desafios no estudo de Vesículas Extracelulares
O interesse por vesículas extracelulares cresceu rapidamente nos últimos anos, impulsionado pelo seu potencial como biomarcadores em diagnóstico e como veículos em terapias avançadas. Esse avanço trouxe também um problema prático já documentado: uma mesma amostra pode gerar resultados diferentes quando medida em plataformas distintas.
Como discutimos no artigo por que a mesma amostra de EVs gera resultados diferentes entre equipamentos, boa parte dessa divergência não é erro de operação, mas consequência de princípios físicos distintos entre técnicas, o que ajuda a entender por que cada etapa do trabalho com EVs, incluindo o preparo da amostra, costuma receber atenção específica.
Abaixo falaremos um pouco das quatro etapas abordadas e tecnologias dedicadas disponibilizadas pela Dafratec:
- Isolamento das EVs a partir de biofluidos e sobrenadantes de cultura.
- Purificação e clean-up para remover contaminantes que geram falso-positivo.
- Marcação e análise das partículas por técnicas fluorescentes e NTA.
- Armazenamento e preservação das EVs para uso posterior e biobanking.
Isolamento das vesículas extracelulares
A primeira etapa da extração de vesículas extracelulares é separar as EVs da matriz biológica original, plasma, soro, urina, líquido cefalorraquidiano ou sobrenadante de cultura celular. É o passo que gera a amostra a ser trabalhada nas etapas seguintes.
Entre os métodos disponíveis, a cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) se destaca por ser suave e por não introduzir vieses de tamanho, preservando a integridade das partículas. A coluna Vesi-SEC Midi aplica essa técnica em formato spin-column, processando amostras de 0,5 a 1,0 mL. O fluxo é direto: carregar, centrifugar e coletar uma única amostra purificada, sem coleta de múltiplas frações e sem diluição do material.
A Vesi-SEC Midi mantém recuperação de partículas superior a 90% na condição de 0,5 mL, combinando a seletividade da SEC com a praticidade da centrifugação.
A escalabilidade também conta no isolamento em rotina. Dependendo da centrífuga utilizada, é possível processar de 1 a 80 amostras simultaneamente, o que atende desde ensaios pontuais até séries experimentais maiores. Além de EVs e exossomos, a mesma coluna é indicada para purificação de vírus a partir de amostras complexas.
A centrífuga certa para rodar o isolamento
A SEC por centrifugação depende de um equipamento com controle de rotação e, idealmente, rotor oscilante (swing-bucket), que favorece uma eluição mais uniforme. Como EVs são sensíveis a variações de temperatura, uma centrífuga refrigerada agrega valor ao proteger a amostra durante o processamento.
As microcentrífugas refrigeradas Purispin e as centrífugas de alta velocidade Velospin oferecem esse controle térmico preciso, com refrigeração estável e compatibilidade com uma ampla faixa de tubos. É o tipo de equipamento usado tanto em protocolos de isolamento por SEC quanto em etapas de clean-up por centrifugação.
Purificação e clean-up das EVs
Depois de isoladas, as EVs quase sempre carregam co-isolados: proteínas solúveis, agregados, lipoproteínas, corantes livres e anticorpos não ligados. Esses componentes não são inertes, eles podem produzir sinal nas análises seguintes.
É um fenômeno bem descrito na literatura: em análises sensíveis, a fluorescência de material não vesicular pode ser contabilizada como evento positivo, inflando concentrações e distorcendo a leitura. Por isso, remover esse material costuma ser tratado como parte relevante do preparo, e não como etapa acessória.
Uma amostra mais limpa tende a reduzir o ruído de fundo gerado por co-isolados, ajudando o instrumento a ler as vesículas com menos interferência.
Para o clean-up de pequenos volumes, a coluna Vesi-SEC Micro purifica amostras de 50 a 100 µL por SEC em aproximadamente um minuto, removendo proteínas, corantes livres e anticorpos em excesso sem diluir a amostra. É especialmente útil em fluxos que envolvem marcação fluorescente ou incubação com anticorpos, quando o excesso de reagente precisa sair antes da leitura.
Essa coluna prepara amostras para uma série de técnicas sensíveis, entre elas:
- Fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis (F-NTA);
- Citometria de fluxo e nano-flow cytometry;
- Fluorescence microfluidics resistive pulse sensing (F-MRPS);
- Microscopia confocal e de super-resolução (SMLM);
- Single-particle interferometric reflectance imaging sensor (SP-IRIS).
Purificar antes de analisar é uma etapa reconhecida no trabalho com EVs justamente por reduzir o sinal de fundo que material não vesicular pode gerar na leitura.
Marcação e análise das partículas
A caracterização de EVs (medir tamanho, concentração e presença de marcadores) é outra etapa distinta do trabalho com vesículas extracelulares. Quando o sinal de espalhamento não basta para distinguir partículas pequenas do ruído, a marcação fluorescente é uma das abordagens usadas.
Os corantes Vesi-Dye LMB são sondas lipofílicas que se intercalam na bicamada lipídica e marcam seletivamente estruturas membranosas, como EVs, exossomos, lipossomas e vírus envelopados. Essa especificidade ajuda a diferenciar partículas com membrana de eventos inespecíficos, como agregados proteicos ou nanobolhas. A linha cobre diferentes faixas espectrais, permitindo adequar o corante ao laser e ao detector do instrumento.
Há aqui uma conexão prática com a etapa de purificação: segundo a própria fabricante, após a marcação recomenda-se usar a Vesi-SEC Micro para remover o corante livre, reduzindo o sinal de fundo antes da leitura. Essa é apenas uma recomendação de uso do produto.
Materiais de referência ajudam a verificar se o sistema está lendo corretamente. O material de referência Vesi-Ref CD63-mNG cumpre esse papel: é um isolado de EVs derivado de células HEK 293 que expressa a proteína fluorescente mNeonGreen associada à tetraspanina CD63. Por ter características físicas próximas às de EVs reais e sinal fluorescente conhecido, serve como controle de sensibilidade e como referência para comparar plataformas e operadores.
Nenhum equipamento isolado é referência absoluta. Validar métricas com métodos ortogonais e materiais de referência é o que sustenta a confiança no dado.
Na análise de tamanho e concentração, o ZetaView, sistema de movimento browniano pela técnica NTA, rastreia partícula a partícula e alcança faixas menores que as plataformas baseadas apenas em espalhamento. Ele também entrega fluorescência multicanal e potencial zeta, o que o torna adequado tanto para NTA quanto para F-NTA de amostras marcadas com Vesi-Dye LMB ou validadas com Vesi-Ref CD63-mNG.
Armazenamento e preservação das EVs
O armazenamento é a etapa que preserva as EVs entre o preparo e o uso posterior. As vesículas são sensíveis a variações de temperatura, mudanças de pH, ciclos de congelamento e descongelamento e à adesão em superfícies plásticas de tubos e consumíveis, fatores que podem reduzir a recuperação e a comparabilidade entre amostras.
O tampão Vesi-Safe foi desenvolvido especificamente para preservar EVs durante diluição, manuseio e armazenamento, ajudando a reduzir a adesão das partículas ao plástico, um problema comum quando se usa apenas PBS. Ele pode ser aplicado logo após o isolamento, seja por SEC, ultracentrifugação ou concentração por TFF, mantendo a amostra mais representativa da população original ao longo do tempo. Não à toa, é o mesmo tampão em que o material de referência Vesi-Ref CD63-mNG é estabilizado.
Para o armazenamento de longo prazo e o biobanking, a temperatura de operação varia conforme a necessidade. As linhas de biobancos e criogenia automatizada cobrem diferentes faixas: o Snorkel é um repositório automatizado de até −80 °C, com recuperação de amostras em segundos, backup por nitrogênio líquido e software de gestão SampleAtlas; o Hatch é um sistema criogênico automatizado a −150 °C; e a série Crest chega a −190 °C, voltada a biobancos de grande escala.
O armazenamento adequado preserva o material entre uma etapa e o próximo uso, evitando que perdas por temperatura ou manuseio comprometam a amostra ao longo do tempo.
Uma solução para cada etapa do trabalho com EVs
O ponto central deste guia é simples: isolar, purificar, analisar e armazenar são etapas distintas e reconhecidas no trabalho com vesículas extracelulares, e a Dafratec tem uma solução dedicada para cada uma delas.
O estudo de vesículas extracelulares ainda enfrenta desafios reconhecidos, especialmente na padronização de métodos entre laboratórios e plataformas. Por isso, sociedades como a ISEV desempenham um papel importante, publicando orientações e guias de boas práticas que ajudam a estruturar cada etapa do estudo de EVs.
Dentro desse cenário, existem soluções dedicadas para cada etapa por que uma amostra passa do isolamento ao armazenamento. Para definir o melhor fluxo de trabalho para sua pesquisa ou estudo, vale combinar as ferramentas adequadas a cada fase com as recomendações atualizadas da ISEV.
Na prática, isso significa escolher a técnica adequada para cada pergunta, contar com colunas de isolamento e clean-up, materiais de referência para validação, um analisador com a faixa de detecção necessária e soluções de preservação e armazenamento compatíveis com o prazo do estudo. Cada uma dessas escolhas é apoiada por um produto específico.
O trabalho com EVs envolve mais do que um instrumento isolado: são etapas distintas do isolamento ao armazenamento, e cada uma conta com sua própria ferramenta.
Quer estruturar a extração de vesículas extracelulares no seu laboratório? Fale com a equipe técnica da Dafratec e descubra como as soluções de isolamento, purificação, análise e armazenamento de EVs podem apoiar sua pesquisa, estudo ou desenvolvimento.
Perguntas frequentes sobre extração de vesículas extracelulares
O que envolve a extração de vesículas extracelulares?
É o conjunto de etapas que costumam fazer parte do trabalho com EVs: isolamento, purificação, marcação e análise, e armazenamento. São etapas distintas e reais; cada uma tem exigências e ferramentas próprias. Não se trata de um protocolo único validado de ponta a ponta, e sim de uma forma de organizar essas etapas.
Por que a purificação das EVs é tão importante antes da análise?
Porque co-isolados como lipoproteínas, agregados proteicos, corantes livres e anticorpos não ligados podem gerar sinal nas análises sensíveis, sendo contabilizados como eventos positivos. Removê-los antes da leitura reduz o ruído de fundo e melhora a confiabilidade dos dados de tamanho e concentração.
Qual a diferença entre isolamento e purificação de EVs?
O isolamento separa as vesículas da matriz biológica original (plasma, urina, cultura). A purificação, ou clean-up, remove contaminantes menores que permanecem junto às EVs após o isolamento, como corantes e proteínas livres, deixando a amostra pronta para análises sensíveis.
Qual coluna SEC usar para cada volume de amostra?
A Vesi-SEC Micro é indicada para pequenos volumes, de 50 a 100 µL, ideal para clean-up e amostras limitadas. A Vesi-SEC Midi atende volumes maiores, de 0,5 a 1,0 mL, com maior capacidade e escalabilidade para isolamento em rotina.
Por que usar tampão específico em vez de PBS para armazenar EVs?
Em determinadas condições, o PBS não preserva bem as EVs, especialmente por permitir a adesão das partículas às superfícies plásticas. Um tampão específico como o Vesi-Safe ajuda a reduzir essa perda e a manter a amostra mais estável durante diluição, manuseio e armazenamento.
O que é um material de referência para vesículas extracelulares?
É uma amostra de composição conhecida usada para validar medições, controlar a sensibilidade do instrumento e comparar plataformas. O Vesi-Ref CD63-mNG, por exemplo, é um isolado de EVs fluorescente que funciona como controle positivo e referência em caracterização ortogonal.
Qual a temperatura correta para armazenar EVs por longos períodos?
Depende da aplicação e do prazo. Para armazenamento prolongado é comum trabalhar a −80 °C, e para criopreservação de longo prazo, faixas ainda mais baixas, próximas a −150 °C. Sistemas de biobanco automatizados ajudam a manter essas condições com segurança e rastreabilidade.
Por que a mesma amostra gera resultados diferentes entre equipamentos?
Porque cada técnica enxerga a amostra por um princípio físico distinto e tem limites de detecção próprios. Cuidados em cada etapa, isolamento, purificação e validação com métodos ortogonais, são práticas reconhecidas no campo para lidar com essa divergência, ainda que a variabilidade método-dependente seja inerente à comparação entre técnicas.
