A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) pode ser utilizada após a marcação de vesículas extracelulares (EVs) para separar as partículas marcadas de parte do corante que permanece não associado às vesículas. Essa etapa é importante porque a presença de DiI não associado ou agregado pode contribuir para o sinal detectado e dificultar a atribuição da fluorescência especificamente às EVs.
A eficiência dessa separação precisa ser demonstrada experimentalmente para cada combinação entre marcador, amostra e método de purificação.
Esse problema experimental ajuda a entender por que a purificação pós-marcação não deve ser tratada apenas como uma etapa preparatória. O comportamento do corante, o perfil de eluição e os controles utilizados influenciam diretamente a interpretação dos resultados.
Dentro desse contexto, tecnologias de SEC como a Standard-Y e o ExoFaster-600, da Upper Biotech, nossa representada, podem integrar fluxos de isolamento e purificação de EVs. Após a separação, técnicas de caracterização como NTA e F-NTA podem complementar a avaliação das partículas recuperadas.
Neste artigo falaremos sobre:
- por que o DiI não associado pode interferir na análise de EVs;
- como a cromatografia por exclusão de tamanho funciona na purificação pós-marcação;
- como interpretar um perfil de eluição de EVs marcadas com DiI;
- quais controles são recomendados para a marcação fluorescente de EVs;
- como a Standard-Y e o ExoFaster-600 podem integrar fluxos baseados em SEC;
- como o ZetaView Evolution pode complementar a caracterização das partículas recuperadas.
Por que o DiI não ligado é relevante na análise de vesículas extracelulares?
O DiI é uma dialquilcarbocianina lipofílica utilizada para marcação de membranas. Corantes dessa classe podem se inserir em estruturas lipídicas e são utilizados em estudos envolvendo rastreamento e detecção de EVs. Entretanto, após a marcação, a preparação pode conter tanto vesículas marcadas quanto corante ou estruturas derivadas do corante que não estão associadas às EVs.
A questão é particularmente importante porque corantes lipofílicos podem apresentar autoagregação. Em estudo publicado no Journal of Extracellular Vesicles, Chen e colaboradores analisaram DiI, PKH26, PKH67 e di-8-ANEPPS por nano-flow cytometry. Os quatro corantes apresentaram formação de agregados ou micelas nos controles contendo somente reagente, embora a extensão desse fenômeno tenha variado entre os corantes e as concentrações avaliadas. DOI: 10.1002/jev2.12351.
Além disso, afinidade por lipídios não significa especificidade por EVs. No mesmo estudo, os quatro corantes avaliados também marcaram partículas de VLDL. O MISEV2023 também chama atenção para o fato de que marcadores lipídicos podem marcar partículas extracelulares não vesiculares contendo lipídios, incluindo lipoproteínas coisoladas.
Um sinal associado ao DiI não é, isoladamente, evidência suficiente para identificar uma partícula como vesícula extracelular.
Por que purificar as EVs depois da marcação?
Depois da incubação das EVs com um marcador fluorescente, a purificação pós-marcação busca reduzir a presença de reagente não associado às vesículas antes da análise. Isso se torna especialmente relevante quando a técnica downstream possui sensibilidade suficiente para detectar pequenas quantidades de fluoróforo, porque sinais provenientes do reagente não ligado podem contribuir para eventos falsos positivos.
Rautaniemi e colaboradores compararam cinco estratégias para remoção de corantes não associados a EVs: ultracentrifugação, ultracentrifugação com gradiente de densidade, ultrafiltração, SEC e cromatografia de troca aniônica. Os resultados mostraram que o comportamento depende das propriedades físico-químicas do corante e que não existe um único método de purificação adequado para todos os marcadores. DOI: 10.1039/D1NA00755F.
Esse estudo não avaliou especificamente o DiI, embora tenha incluído outros marcadores lipofílicos, entre eles DiO. Sua contribuição para esta discussão é mostrar que a eficiência da combinação entre corante e método de purificação precisa ser avaliada experimentalmente, em vez de ser presumida a partir do princípio teórico da técnica.
A necessidade de purificação é bem estabelecida; sua eficiência deve ser verificada para as condições específicas do experimento.
Como a cromatografia por exclusão de tamanho atua nessa separação?
A cromatografia por exclusão de tamanho utiliza uma matriz porosa para separar componentes de acordo com seu acesso ao volume interno dos poros. Espécies maiores penetram menos na matriz e tendem a eluir anteriormente; moléculas menores acessam uma parcela maior do volume poroso e apresentam eluição mais tardia. Esse princípio é amplamente empregado em fluxos de isolamento e purificação de EVs.
Dependendo da matriz, da geometria da coluna, do volume aplicado e das características da amostra, podem ser obtidas frações iniciais enriquecidas em partículas maiores e frações posteriores contendo maior proporção de proteínas solúveis e outras espécies menores.
SEC, entretanto, não identifica biologicamente uma EV. A separação ocorre predominantemente de acordo com propriedades hidrodinâmicas. Por isso, partículas extracelulares não vesiculares com características semelhantes podem permanecer nas mesmas frações, questão particularmente relevante em matrizes complexas como plasma.
SEC realiza um fracionamento físico; a identidade vesicular precisa ser estabelecida por caracterização complementar.
Standard-Y: SEC aplicada à purificação pós-marcação com DiI
Um exemplo prático dessa aplicação é a coluna Standard-Y, da Upper Biotech, nossa representada para soluções voltadas ao isolamento de vesículas extracelulares. Em um ensaio com EVs previamente marcadas com DiI, foram acompanhados o sinal associado ao corante e a concentração de proteínas ao longo de 21 frações obtidas por SEC.
O perfil foi dividido em três regiões: “Void-volume fractions”, “EV-containing fractions” e “Contaminant-rich fractions”. O gráfico combina concentração proteica no eixo esquerdo com absorbância de DiI a 550 nm no eixo direito e apresenta condições de 1 µM e 5 µM de DiI. Nas frações classificadas como contendo EVs observa-se o principal aumento do sinal associado ao DiI, enquanto as maiores concentrações de proteína aparecem predominantemente nas frações posteriores.
O perfil ilustra como a distribuição do marcador e das proteínas pode ser acompanhada ao longo da separação. Para interpretar essas frações biologicamente, porém, é importante combinar o cromatograma com controles e técnicas complementares de caracterização das partículas recuperadas.
Nas condições avaliadas, o perfil da Standard-Y mostra separação entre a região com maior sinal de DiI e o aumento de concentração proteica observado nas frações posteriores.
Como interpretar perfil de eluição, identidade, pureza e recuperação?
O perfil de eluição informa como sinais e componentes da amostra se distribuem ao longo das frações. A presença de DiI em determinada fração demonstra a presença do marcador, mas não determina isoladamente a identidade das estruturas responsáveis por esse sinal, especialmente considerando a possibilidade de agregação do corante e de marcação de partículas lipídicas não vesiculares.
Pureza responde a outra pergunta. Uma menor concentração de proteína em determinadas frações pode indicar separação de parte das proteínas solúveis, mas proteína total não representa todas as possíveis populações não vesiculares. A caracterização de uma preparação de EVs pode exigir a combinação de diferentes medidas e marcadores.
Recuperação também é um parâmetro distinto. A Standard-Y é uma solução High-Yield, desenvolvida para priorizar a recuperação de EVs. A quantificação efetiva da recuperação em cada experimento, entretanto, depende da comparação entre o material de entrada e o material obtido após a separação utilizando métricas apropriadas.
Perfil de eluição, identidade das partículas, pureza e recuperação respondem a perguntas experimentais diferentes e devem ser avaliados com evidências apropriadas.
Quais controles são recomendados para a marcação fluorescente de EVs?
O MISEV2023 dedica uma seção específica à marcação proteica e não proteica de EVs e recomenda controles capazes de identificar artefatos introduzidos pelo reagente. Um deles é o controle contendo tampão e marcador, sem EVs, que permite observar sinais produzidos pelo próprio reagente na ausência das vesículas.
Quando existe purificação após a marcação, o documento recomenda avaliar esse controle antes e depois do procedimento utilizado para remover o excesso de marcador, incluindo SEC como uma das possibilidades. EVs não marcadas também devem ser submetidas às condições apropriadas para estabelecer sinal de fundo e avaliar possíveis efeitos introduzidos pelo procedimento.
Uma publicação de 2026 no Journal of Extracellular Vesicles, intitulada No Dye Fits All: Illuminating the Challenges of Fluorescent Extracellular Vesicle Labeling, reforça controles como buffer-only, dye-only e EVs não marcadas e destaca que a remoção do corante não ligado deve ser avaliada experimentalmente. DOI: 10.1002/jev2.70291.
O controle com DiI na ausência de EVs ajuda a identificar quanto do sinal pode ser produzido pelo próprio marcador.
Da SEC manual à automação: onde entra o ExoFaster-600?
Para fluxos que exigem maior automação e padronização da etapa de isolamento, nosso portfólio inclui o ExoFaster-600, da Upper Biotech. A plataforma utiliza cromatografia por exclusão de tamanho em um processo automatizado para isolamento de vesículas extracelulares.
O ExoFaster-600 permite selecionar de 1 a 9 amostras por corrida e processa nove amostras em 48 minutos. O sistema é destinado a uso em pesquisa (Research Use Only – RUO).
A relação com a Standard-Y está no princípio de separação por SEC. O perfil apresentado anteriormente refere-se especificamente ao experimento realizado com a Standard-Y; o ExoFaster-600 representa a possibilidade de incorporar esse princípio em um fluxo automatizado.
Para rotinas com múltiplas amostras, a automação permite incorporar a SEC a um fluxo mais padronizado de isolamento de EVs.
Conheça o ExoFaster-600 e suas aplicações no isolamento automatizado de vesículas extracelulares.
Da separação à caracterização
Após o isolamento ou a purificação, a caracterização das partículas recuperadas adiciona informações que o perfil de eluição sozinho não fornece. Parâmetros como distribuição de tamanho e concentração de partículas ajudam a descrever as frações obtidas e a comparar diferentes etapas do fluxo experimental.
Em nosso portfólio, o ZetaView® Evolution , da Particle Metrix, utiliza Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) para determinar tamanho hidrodinâmico e concentração de nanopartículas a partir do rastreamento de seu movimento browniano. A plataforma também oferece recursos de potencial zeta e, dependendo da configuração, análise por fluorescência (F-NTA) e colocalização (C-NTA).
No contexto de EVs separadas por SEC, o ZetaView pode complementar a avaliação das frações selecionadas por meio da caracterização de tamanho e concentração das partículas. Quando são utilizadas análises fluorescentes, a escolha do marcador e a configuração óptica do sistema precisam ser compatíveis com o ensaio. NTA e F-NTA complementam a caracterização, mas não substituem, isoladamente, outros critérios necessários para estabelecer identidade vesicular.
A SEC separa as frações; técnicas como NTA e F-NTA ajudam a caracterizar as partículas recuperadas.
Quer avançar da separação para a caracterização das suas EVs? Conheça o ZetaView Evolution ou fale com nossa equipe .
Conclusão: separar, controlar e caracterizar são etapas complementares
A marcação de vesículas extracelulares com DiI pode fornecer informações valiosas em estudos baseados em fluorescência, mas a presença do marcador não deve ser interpretada de forma isolada. Corante não associado, autoagregados e partículas lipídicas não vesiculares podem contribuir para o sinal observado.
A cromatografia por exclusão de tamanho oferece uma estratégia para fracionar a preparação após a marcação. Soluções como a Standard-Y permitem aplicar SEC em protocolos de bancada, enquanto o ExoFaster-600 leva o mesmo princípio para um fluxo automatizado de isolamento.
Depois da separação, a caracterização das partículas recuperadas completa uma parte importante do fluxo analítico. Técnicas como NTA e F-NTA, disponíveis no ZetaView Evolution, podem acrescentar informações sobre tamanho, concentração e subpopulações fluorescentes quando aplicável. Na prática, resultados robustos surgem da combinação entre separação adequada, controles experimentais e caracterização complementar.
Em estudos de EVs marcadas com DiI, o cromatograma é uma parte da resposta: controles e caracterização são o que permitem transformar o sinal observado em uma interpretação experimental consistente.
Perguntas frequentes sobre DiI, SEC e vesículas extracelulares
O que é DiI e por que ele é utilizado em vesículas extracelulares?
DiI é um corante lipofílico da família das dialquilcarbocianinas utilizado para marcação de membranas. Em estudos com EVs, ele pode se associar a estruturas lipídicas e permitir a detecção das partículas marcadas por técnicas baseadas em fluorescência.
Por que o DiI não associado às EVs precisa ser considerado?
Porque o marcador não associado pode contribuir para o sinal medido. Além disso, DiI pode formar autoagregados em determinadas condições, o que torna necessários controles capazes de distinguir eventos relacionados às EVs daqueles originados pelo próprio corante.
A cromatografia por exclusão de tamanho remove completamente o DiI livre?
Não é possível afirmar isso de forma geral. A eficiência depende do marcador, da matriz cromatográfica, das condições de separação e das características da amostra. Por isso, a remoção do corante residual deve ser avaliada experimentalmente.
Um sinal positivo para DiI confirma que a partícula é uma EV?
Não. Corantes lipofílicos também podem estar associados a agregados ou a partículas lipídicas não vesiculares. A identidade das EVs deve ser investigada com controles e métodos de caracterização complementares.
Quais controles são importantes em experimentos com EVs marcadas com DiI?
Entre os controles relevantes estão tampão sem marcador, marcador sem EVs, EVs não marcadas e amostras processadas pelas mesmas etapas de purificação utilizadas no experimento. O objetivo é estabelecer o sinal de fundo e identificar possíveis artefatos introduzidos pelo marcador ou pelo procedimento.
Qual é a diferença entre a Standard-Y e o ExoFaster-600?
A Standard-Y é uma solução de SEC utilizada em separações por coluna, enquanto o ExoFaster-600 é uma plataforma automatizada para isolamento de vesículas extracelulares baseada em SEC. Ambos utilizam o princípio de separação por tamanho, mas atendem formatos diferentes de fluxo de trabalho.
Como o ZetaView Evolution complementa um fluxo de isolamento de EVs por SEC?
Após a coleta das frações, o ZetaView Evolution pode utilizar NTA para determinar tamanho hidrodinâmico e concentração das partículas recuperadas. Dependendo da configuração e do ensaio, recursos de F-NTA e C-NTA permitem acrescentar informações de fluorescência e colocalização. Esses dados complementam, mas não substituem isoladamente, outros critérios de caracterização de EVs.
