Para reduzir a limitação de oxigênio em cultivos microbianos de alta densidade, é necessário equilibrar a disponibilidade de oxigênio com a velocidade de crescimento e a alimentação de substrato.
Na Application Note Aerobic cultivation of high-oxygen-demanding microorganisms in the BioLector XT microbioreactor, a Beckman Coulter Life Sciences investigou essa relação utilizando o microbioreator BioLector XT em cultivos de Escherichia coli e Vibrio natriegens, comparando diferentes estratégias de alimentação sob ar atmosférico e ar enriquecido com oxigênio.
Em processos fed-batch, fornecer mais glicose sem garantir transferência suficiente de O₂ pode levar à queda do oxigênio dissolvido (DO), reduzir a taxa específica de crescimento e favorecer alterações metabólicas e a formação de subprodutos como acetato, lactato e etanol.
Por outro lado, aumentar a concentração de oxigênio também não é uma solução isolada, já que concentrações elevadas de O₂ podem favorecer a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS).
Em cultivos de alta densidade, alimentação e disponibilidade de oxigênio precisam ser avaliadas em conjunto.
Por que o oxigênio se torna um problema em cultivos de alta densidade?
À medida que a biomassa aumenta, cresce também a demanda metabólica por oxigênio. Se a transferência de O₂ não acompanhar esse consumo, o oxigênio dissolvido pode atingir níveis críticos.
O problema não se resume a uma desaceleração do crescimento. A limitação de oxigênio pode modificar o metabolismo celular e favorecer a formação de metabólitos indesejados. Em E. coli, por exemplo, a formação de acetato está associada ao chamado metabolismo overflow.
Por isso, aumentar a alimentação de substrato não significa necessariamente melhorar o desempenho do cultivo. Quanto maior a disponibilidade de glicose e a velocidade de crescimento, maior pode ser também a demanda por oxigênio.
Esse desafio se torna particularmente evidente em organismos de crescimento muito rápido.
Vibrio Natriegens: Crescimento Rápido e Alta Demanda por Oxigênio
Vibrio natriegens é uma bactéria Gram-negativa de crescimento extremamente rápido, com tempos de geração reportados de apenas 9,4 minutos em condições ideais. Essa característica faz do microrganismo uma plataforma de interesse para aplicações biotecnológicas, mas também está associada a altas taxas de consumo de glicose e oxigênio.
Um trabalho anterior citado na Application Note reportou cultivos fed-batch de alta densidade de V. natriegens com taxas de consumo de oxigênio de até 500 mmol·L⁻¹·h⁻¹. Nessas condições, foi utilizado ar enriquecido com 60% de oxigênio para manter o DO em 40% da saturação do ar.
Surge então uma questão importante no desenvolvimento do processo:
quanto substrato pode ser fornecido sem fazer com que a demanda metabólica ultrapasse a capacidade de transferência de oxigênio do cultivo?
Como o experimento foi realizado
Para investigar essa relação, os pesquisadores utilizaram o BioLector XT equipado com módulo microfluídico e Gen2 Microfluidic FlowerPlate.
A configuração permitiu acompanhar em tempo real biomassa, pH e DO, além de controlar a alimentação e a composição gasosa. Especificamente nesta Application Note, os experimentos compararam ar atmosférico com 21% de O₂ e ar enriquecido com até 50% de O₂, ambos com vazão fixa de 50 mL/min. (Beckman Coulter)
A Figura 2 ajuda a entender a configuração experimental. A placa utilizada possui 32 poços de cultivo com optodos para medições ópticas de pH e DO. Os reservatórios são conectados aos poços de cultivo por canais microfluídicos, possibilitando a adição controlada das soluções durante o experimento.
O que aconteceu com E. coli quando o oxigênio se tornou limitante?
Nos cultivos fed-batch de E. coli com alimentação constante, a diferença entre as condições apareceu pouco depois do início do fornecimento de glicose.
Com ar atmosférico, a transferência de oxigênio deixou de atender à demanda do cultivo e ocorreu limitação de O₂ durante o restante do experimento. Nas condições avaliadas com enriquecimento de oxigênio, a cultura conseguiu manter crescimento exponencial por mais tempo e apresentou maior concentração de biomassa que o cultivo limitado por oxigênio.
Na Figura 3, vale observar principalmente a queda do DO após o início da alimentação e a diferença entre as curvas obtidas com ar atmosférico e oxigênio enriquecido.
O comportamento do pH também mudou. O cultivo limitado por oxigênio exigiu maior adição de NaOH e, mesmo assim, o pH ficou aproximadamente 0,1 unidade abaixo do setpoint. Os autores sugerem que a maior produção de metabólitos secundários, como acetato, associada ao metabolismo overflow pode explicar essa acidificação.
A limitação de oxigênio não afetou apenas o crescimento. Os resultados indicaram também uma mudança no comportamento metabólico do cultivo.
Os pesquisadores repetiram a comparação utilizando um perfil de alimentação linear crescente.
Na Figura 4, o ponto principal é que o comportamento geral se repete. Nas condições testadas, os cultivos com ar atmosférico tornaram-se limitados por oxigênio pouco depois do início da alimentação, enquanto o enriquecimento com O₂ evitou essa limitação durante o período analisado.
Os resultados reforçam que feed rate e disponibilidade de oxigênio são variáveis interdependentes no desenvolvimento de um cultivo fed-batch.
E se o próprio oxigênio controlar a alimentação?
No experimento com V. natriegens, os pesquisadores foram além de uma taxa fixa de alimentação e utilizaram o próprio DO como sinal para controlar a adição de substrato.
Especificamente para esse experimento, o sistema foi configurado para adicionar 4 µL da solução de alimentação rica em glicose sempre que o DO estivesse acima de 6%. O valor de 6% foi um parâmetro definido para essa estratégia experimental e não deve ser interpretado como um limite universal para outros cultivos.
A lógica é simples.
Quando o DO ultrapassa o valor definido, a solução de alimentação é adicionada. Com glicose disponível, o metabolismo aeróbio aumenta o consumo de oxigênio e o DO diminui. Quando o valor fica abaixo do limite estabelecido, a alimentação é interrompida. Após o consumo do substrato e a recuperação do DO, uma nova alimentação pode ser acionada.
O sinal de oxigênio dissolvido deixa de ser apenas uma variável monitorada e passa a participar diretamente do controle da alimentação.
Mais de 30 ciclos de alimentação controlados pelo DO
A Figura 5 mostra claramente a diferença entre os cultivos de V. natriegens sob as duas condições de oxigenação.
Com 50% de O₂, o enriquecimento de oxigênio manteve o DO acima de 6% por aproximadamente 5,75 horas. O cultivo chegou a apresentar limitação de oxigênio por volta de 6 horas, fazendo com que a alimentação fosse interrompida até a recuperação do DO.
A partir daí, o mecanismo de controle passou a alternar alimentação e pausa conforme a disponibilidade de oxigênio.
Esse ciclo foi repetido mais de 30 vezes, com a adição de quase 200 µL da solução de alimentação rica em glicose durante as 6,5 horas restantes do experimento. Nenhum desses eventos individuais de alimentação levou à depleção completa do oxigênio na fase líquida.
Na comparação com ar atmosférico, o cultivo enriquecido com oxigênio recebeu mais de cinco vezes mais solução de alimentação. Já na condição com ar atmosférico, ocorreram períodos mais longos de depleção completa de oxigênio após os pulsos, acompanhados por comportamento mais irregular de biomassa e pH.
Os autores interpretam essas oscilações como indicativas de mudanças no metabolismo, incluindo possível utilização temporária de ácidos produzidos como metabólitos overflow. Como esses metabólitos não foram diretamente quantificados nesse experimento, essa interpretação deve ser entendida como uma hipótese baseada no comportamento observado de DO, pH e biomassa.
Mais oxigênio significa necessariamente mais biomassa?
Não.
Apesar da quantidade muito maior de solução de alimentação fornecida, a concentração final de biomassa de V. natriegens foi bastante semelhante entre os dois cultivos fed-batch apresentados.
Os autores apontam que a formação relativamente baixa de biomassa na condição enriquecida pode indicar menor rendimento de glicose em biomassa e possível maior formação de produtos ou metabólitos overflow. Essa possibilidade, porém, não foi diretamente quantificada no experimento.
Esse resultado é importante porque mostra que enriquecer o cultivo com oxigênio não significa automaticamente obter mais biomassa ou maior produtividade.
O valor do controle de oxigênio está em ampliar as condições que podem ser investigadas e tornar o processo mais controlável, não simplesmente em fornecer mais O₂.
O que esses resultados mostram para o desenvolvimento de bioprocessos?
Os experimentos mostram que o desenvolvimento de um cultivo fed-batch precisa considerar não apenas quanto substrato fornecer, mas quanto substrato o organismo consegue metabolizar dentro das condições de transferência de oxigênio disponíveis.
Monitorar continuamente biomassa, pH e DO também permite utilizar essas informações no desenvolvimento de estratégias de controle em closed-loop, como demonstrado pela alimentação acionada pelo DO no cultivo de V. natriegens.
Foi justamente essa combinação de recursos que o BioLector XT permitiu explorar neste trabalho:
- cultivos paralelos em microescala,
- monitoramento online de parâmetros do cultivo,
- controle microfluídico da alimentação e
- ajuste da composição gasosa.
Como aplicar essa abordagem no desenvolvimento de bioprocessos?
Atualmente, a plataforma BioLector XT oferece monitoramento em tempo real de parâmetros como biomassa, fluorescência, pH e DO, além de opções de controle de alimentação e pH por microfluídica e ajuste da composição gasosa.
Para laboratórios que trabalham com desenvolvimento e otimização de bioprocessos, esse tipo de abordagem permite investigar em microescala como diferentes combinações de alimentação, oxigenação e parâmetros de controle interferem no comportamento do cultivo.
A Dafratec disponibiliza o BioLector XT no Brasil e pode auxiliar pesquisadores e equipes de bioprocessos na avaliação da tecnologia para suas estratégias de cultivo.
Quer avaliar como o controle de alimentação, pH e oxigênio dissolvido pode ser aplicado aos seus cultivos? Entre em contato com a equipe da Dafratec e conheça as possibilidades do BioLector XT para desenvolvimento de bioprocessos em microescala.
Perguntas Frequentes sobre Oxigenação e Cultivo Fed-Batch de Microrganismos
1. O que causa limitação de oxigênio em cultivos microbianos de alta densidade?
A limitação de oxigênio ocorre quando a demanda metabólica das células por O₂ supera a capacidade do sistema de transferir oxigênio para o meio de cultivo. À medida que a biomassa e a velocidade de crescimento aumentam, o consumo de oxigênio também pode aumentar. Por isso, em cultivos de alta densidade, a taxa de alimentação de substrato e a disponibilidade de oxigênio precisam ser avaliadas em conjunto.
2. Qual é a relação entre glicose, oxigênio dissolvido e metabolismo overflow em E. coli?
Em cultivos fed-batch de E. coli, aumentar a disponibilidade de glicose pode elevar a atividade metabólica e, consequentemente, a demanda por oxigênio. Quando essa demanda ultrapassa a capacidade de transferência de O₂, ocorre limitação de oxigênio e podem surgir alterações metabólicas. No estudo apresentado, os autores associaram a maior acidificação observada na condição limitada por oxigênio à possível maior formação de metabólitos secundários, como acetato, relacionada ao metabolismo overflow.
3. O que é alimentação controlada por oxigênio dissolvido em um cultivo fed-batch?
É uma estratégia de controle em que o valor de oxigênio dissolvido (DO) é utilizado como sinal para determinar quando o substrato deve ser adicionado. No experimento com Vibrio natriegens, foram adicionados 4 µL de solução de alimentação rica em glicose sempre que o DO estava acima de 6%. Quando o consumo metabólico fazia o DO cair abaixo desse valor, a alimentação era interrompida até que o oxigênio se recuperasse. O limite de 6% foi específico dessa estratégia experimental e não representa um valor universal para outros cultivos.
4. Por que Vibrio natriegens apresenta desafios relacionados à oxigenação?
Vibrio natriegens é uma bactéria de crescimento extremamente rápido e, por isso, pode apresentar elevada demanda metabólica por substrato e oxigênio. O artigo cita tempos de geração reportados de 9,4 minutos em condições ideais e um trabalho anterior com cultivos fed-batch de alta densidade que alcançou taxas de consumo de oxigênio de até 500 mmol·L⁻¹·h⁻¹. Essas características tornam particularmente importante equilibrar alimentação e capacidade de transferência de oxigênio durante o desenvolvimento do processo.
5. Aumentar a concentração de oxigênio sempre aumenta a biomassa?
Não. No experimento com V. natriegens, o cultivo com ar enriquecido recebeu mais de cinco vezes mais solução de alimentação do que a condição com ar atmosférico, mas a concentração final de biomassa foi bastante semelhante entre os dois cultivos. Os autores levantaram como possibilidade um menor rendimento de glicose em biomassa e maior formação de produtos ou metabólitos overflow, mas esses compostos não foram diretamente quantificados no experimento. Portanto, maior disponibilidade de oxigênio não deve ser interpretada automaticamente como maior produção de biomassa.
6. Quais parâmetros devem ser monitorados para controlar um cultivo fed-batch em microescala?
No estudo apresentado, foram monitorados em tempo real biomassa, pH e oxigênio dissolvido (DO). O BioLector XT também permitiu controlar a alimentação por microfluídica e modificar a composição gasosa. A combinação dessas variáveis possibilitou avaliar como alimentação e oxigenação interferiam no comportamento dos cultivos e, no experimento com V. natriegens, utilizar o próprio DO como variável de uma estratégia de controle em closed-loop.
7. Como o BioLector XT pode ser usado na otimização de bioprocessos microbianos?
O BioLector XT permite realizar cultivos paralelos em microescala e acompanhar parâmetros como biomassa, fluorescência, pH e oxigênio dissolvido em tempo real. A plataforma também oferece opções de controle de alimentação e pH por microfluídica e ajuste da composição gasosa. Esses recursos permitem investigar diferentes combinações de alimentação, oxigenação e parâmetros de controle durante o desenvolvimento e a otimização de bioprocessos.
Leituras indicadas
- High-cell-density fed-batch cultivations of Vibrio natriegens - Acessar o artigo no PubMed
- Avoiding acetate accumulation in Escherichia coli cultures using feedback control of glucose feeding - Acessar o artigo no PubMed
- Control and regulation of acetate overflow in Escherichia coli - Acessar o artigo completo
