Resumo
A determinação precisa e confiável da concentração de nanopartículas é crucial para uma ampla gama de aplicações. Ela é essencial tanto para a liberação de produtos contendo partículas técnicas, como padrões de calibração, quanto para a quantificação de vesículas extracelulares (EVs) na pesquisa biofarmacêutica, onde essas vesículas atuam como biomarcadores de doenças ou são utilizadas no desenvolvimento de terapias seguras e eficazes.
No entanto, os resultados experimentais das medições de concentração de nanopartículas nos modos de espalhamento e fluorescência são altamente dependentes das configurações de gravação, tanto na citometria de fluxo (FC) quanto na análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Por isso, a calibração com material de referência é necessária para medir com precisão amostras que variam em material, tamanho de partícula e fluorescência, garantindo resultados confiáveis.
Neste boletim técnico, apresentamos nossa nova Tecnologia de Varredura de Concentração, um método inovador de medição de concentração que utiliza uma varredura contínua por microscopia em toda a célula de medição, implementado em nosso novo software ZetaSphere. Esse novo método reduz significativamente a influência dos níveis variáveis da câmera, permitindo uma determinação de concentração rápida e precisa sem necessidade de calibração adicional. Isso, por sua vez, facilita a comparação e medição de partículas fluorescentes, bem como de partículas com diferentes tamanhos e materiais, garantindo resultados reproduzíveis entre diferentes dispositivos.
De forma geral, nossa nova varredura de concentração representa um método de medição mais simples, rápido e preciso, fácil de usar com uma ampla variedade de amostras e aplicações, fornecendo resultados reprodutíveis em uma ampla faixa de sensibilidade — tornando-se assim o novo padrão para nossos dispositivos NTA.
Figura 1: Representação esquemática de dois métodos diferentes de medição de concentração. À esquerda: Medição discreta de concentração em 11 posições. À direita: Varredura contínua de concentração através da célula de medição.
Introdução
A determinação de concentração é um método de medição essencial para a análise precisa de nanopartículas, especialmente nas áreas da medicina, ciências da vida, indústria farmacêutica, ciência dos materiais e análise ambiental. Ela garante o cumprimento de dosagens exatas, padrões de qualidade e requisitos regulatórios¹². Assim, a medição da concentração de partículas desempenha um papel fundamental na pesquisa com exossomos e vesículas, pesquisa de vírus e câncer, desenvolvimento de vacinas e no controle de qualidade de medicamentos e sistemas de liberação baseados em nanopartículas³–⁵. Além disso, a determinação de concentração é crucial na caracterização de nanopartículas sintéticas, como ouro, sílica ou poliestireno, bem como na quantificação de micro e nanoplásticos em cosméticos, alimentos ou amostras de água⁶–⁹.
As técnicas mais comumente utilizadas para determinar a concentração de nanopartículas incluem espalhamento dinâmico de luz (DLS), citometria de fluxo e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Nas últimas décadas, a NTA em particular se destacou como o método mais amplamente utilizado e popular para medições de concentração, embora a citometria de fluxo também tenha apresentado avanços significativos em sensibilidade graças ao desenvolvimento contínuo¹⁰–¹². Ao contar diretamente partículas individuais, a NTA permite uma medição precisa da concentração tanto nos modos de espalhamento quanto de fluorescência, funcionando para amostras mono e polidispersas em uma ampla faixa de tamanhos nanométricos.
No entanto, medições precisas exigem calibração com material de referência, e para a quantificação de partículas é essencial considerar os efeitos de variáveis específicas de cada equipamento na caracterização das partículas. Por exemplo, o resultado de uma medição de concentração depende das configurações de gravação, da potência do laser e dos algoritmos de rastreamento utilizados¹³. Uma maior sensibilidade da câmera leva a um número maior de partículas no campo de visão, resultando em um volume de medição diferente e, consequentemente, em uma concentração de partículas mais alta. Além disso, é necessária uma calibração utilizando fatores específicos de concentração e fluorescência para se obter resultados precisos.
De acordo com a norma ISO 24672, “A maior incerteza na contagem de partículas com PTA [análise de rastreamento de partículas] é a profundidade de campo dependente da amostra e do instrumento e, portanto, o volume de detecção resultante¹³.” Isso se aplica tanto a medições realizadas em uma única posição quanto em múltiplas posições de gravação.
Conseguimos superar essa limitação conhecida e apresentamos um novo método de medição de concentração. Enquanto anteriormente a concentração era determinada com base no número de partículas em diferentes posições de medição individuais, nosso novo método utiliza uma varredura por microscopia para detectar todas as partículas em todo o volume de medição. A concentração de partículas é então determinada por meio de um algoritmo NTA incorporado em nosso novo software ZetaSphere (Figura 1).
A varredura rápida permite analisar milhares de partículas em apenas 12 segundos, o que melhora a estatística e a precisão dos resultados de concentração. Ao escanear todo o volume de medição, é possível obter resultados consistentes de medição, praticamente independentes das configurações escolhidas da câmera, já que os problemas relacionados à profundidade de campo são eliminados.
Portanto, a escolha das configurações ideais do instrumento e das diluições da amostra muitas vezes não é trivial para o usuário, o que pode dificultar a comparação de resultados entre diferentes operadores ou equipamentos. Esse recurso garante resultados de medição precisos, estáveis e reprodutíveis em uma ampla faixa de parâmetros da câmera, tanto no modo de espalhamento quanto no modo de fluorescência, para partículas pequenas (50 nm) e grandes (500 nm). Os usuários se beneficiam de uma abordagem muito simplificada para a medição de concentração, tornando a quantificação de partículas amplamente independente das configurações de gravação, o que permite resultados comparáveis entre diferentes tipos de amostras, bem como entre diferentes canais de medição, como espalhamento e fluorescência. Além disso, nossa nova medição de concentração não requer calibração prévia de concentração, levando a resultados precisos e melhor comparabilidade entre diferentes instrumentos.
Aqui, demonstramos o desempenho da nossa nova varredura de concentração. A aplicação de diferentes padrões de contagem (100 nm) em múltiplos dispositivos confirmou a precisão e a estabilidade da medição com nosso novo método. As varreduras de concentração nos modos de espalhamento e fluorescência mostraram valores estáveis de concentração em uma ampla faixa de sensibilidade e com diferentes configurações de aquisição, verificando a influência minimizada das configurações da câmera nos resultados da medição. Além disso, as medições de padrões de diferentes tamanhos ressaltaram a estabilidade do método para uma grande faixa de tamanhos (50–500 nm). Finalmente, as medições de concentração em amostras reais com tamanho desconhecido e fluorescência variável revelaram resultados precisos, tornando este método uma aplicação ideal para a determinação de concentração de vesículas extracelulares (EVs) e estabelecendo nossa patenteada Tecnologia de Varredura de Concentração como o novo padrão para nossos dispositivos NTA.
Resultados
Validação da Tecnologia de Varredura de Concentração usando padrões de contagem
O desempenho da nossa nova Tecnologia de Varredura de Concentração foi validado utilizando padrões de contagem comerciais de 100 nm (Figura 2). A varredura de concentração foi realizada em diferentes dispositivos ZetaView® usando padrões de diferentes fabricantes e materiais, incluindo poliestireno e SiO₂. A concentração de partículas medida está dentro do intervalo de confiança especificado pelo fabricante e apresenta uma alta comparabilidade entre dispositivos, garantindo resultados confiáveis e reprodutíveis com a nova varredura.
Figura 2: Validação da varredura de concentração utilizando diferentes padrões de contagem. Os experimentos foram conduzidos em diferentes dispositivos para avaliar a comparabilidade entre eles. Os resultados estão em excelente concordância com as especificações dos fabricantes das partículas.
Redução da influência das configurações de gravação
Até agora, os resultados da medição de concentração dependiam das configurações de gravação escolhidas, o que tornava necessária a calibração para cada configuração. Para resolver isso, comparamos a nova varredura de concentração desenvolvida com o método de medição de concentração por NTA, que está em conformidade com a norma ISO 24672. Este método é calibrado utilizando um padrão de poliestireno de 100 nm e é referido como “medição em 11 posições” a seguir.
A concentração dos padrões de contagem de poliestireno de 100 nm foi determinada para diferentes configurações da câmera (Figura 3). Os resultados mostram que a varredura permanece precisamente dentro da faixa de aceitação de concentração do fabricante, mesmo com alterações significativas no ganho da câmera. Em contraste, a medição em 11 posições fornece resultados válidos apenas para as configurações calibradas de gravação (ganho 30). Isso demonstra a maior tolerância da varredura de concentração em relação às configurações de gravação, o que é particularmente útil para amostras desconhecidas, para as quais as configurações da câmera precisam ser ajustadas.
Essa característica pode ser explicada pelas propriedades subjacentes dos diferentes métodos de medição. No método convencional compatível com a ISO, as partículas são detectadas dentro de uma lâmina de luz, e a concentração delas é determinada usando um fator de calibração. No entanto, o número de partículas detectadas é diretamente influenciado pelas configurações da câmera. Um aumento na sensibilidade da câmera amplia o volume de detecção, levando à detecção de mais partículas. Consequentemente, as configurações da câmera têm impacto direto na concentração medida, como demonstrado pelo aumento da concentração com configurações de ganho mais altas. Isso torna a calibração necessária para obter resultados precisos de concentração absoluta.
Notavelmente, esse efeito é significativamente reduzido pelo nosso novo método de Varredura de Concentração. Ele detecta partículas dentro de um volume de medição pré-definido, independente do volume de detecção, que é influenciado pelas configurações do laser e da câmera. Isso se reflete nos valores estáveis de concentração observados em diferentes configurações de sensibilidade. É importante notar que o aumento do ganho dentro de uma faixa razoável não altera artificialmente o volume de medição. Em vez disso, afeta principalmente a detecção de partículas menores ou que dispersam ou fluorescem pouco. Contudo, o limite superior de sensibilidade é restringido no ponto em que o ruído leva a detecções falsas positivas.
Figura 3: Medições de concentração de um padrão de poliestireno de 100 nm. Comparação entre a varredura de concentração e a medição em 11 posições sob diferentes configurações da câmera, demonstrando que a varredura alcança resultados precisos em todas as variações de ganho, enquanto a medição em 11 posições alcança resultados precisos apenas para o nível de ganho determinado pela calibração.
Determinação de concentração para diferentes tamanhos de partículas
A redução da influência das configurações da câmera nos resultados da medição também é observada ao medir nanopartículas em diferentes faixas de tamanho. As medições foram realizadas com amostras de poliestireno na faixa de 50 nm a 500 nm (Figura 4). Enquanto o método de medição de concentração em 11 posições apresenta excelente concordância com as especificações do fabricante para 60 nm e 100 nm, a varredura de concentração fornece resultados precisos em uma faixa de medição ampliada, de 50 nm a 500 nm, sem necessidade de calibração adicional, o que é particularmente vantajoso para analisar amostras com partículas de tamanho desconhecido.
Figura 4: Medição da concentração de partículas de poliestireno na faixa de 50 a 500 nm. A varredura de concentração está em conformidade com as especificações dos fabricantes em toda a faixa de tamanho das partículas, enquanto a medição em 11 posições, calibrada para 100 nm, superestima as partículas na faixa de 200 a 500 nm, comprovando a necessidade de uma calibração precisa para se obter valores absolutos de concentração por esse método.
Concentration measurements of samples labeled with four fluorescent dyes per particle
The dependence of results on recording settings is not only evident for different particle sizes, but especially for fluorescent samples. Here, the intensity of the scattered light from the particles and the emitted fluorescence from the fluorophores differs significantly depending on particle size and number of fluorophores. Additionally, each laser has a unique beam profile and intensity, which must be considered in the conventional NTA concentration method by determining a concentration correction factor using fluorescent reference beads. The stability of the concentration scan regarding fluorescence was analyzed through concentration measurements of fourfold labeled samples (Figure 5). In the concentration scan, all concentration values show a deviation of less than 5%, indicating measurement consistency over all channels. In contrast, measurements taken at 11 different positions exhibit significant variance, as they are more strongly affected by the laser profile and the specific camera settings.
Figura 5: Medições de concentração de partículas de 100 nm marcadas com 4 fluoróforos diferentes (TetraSpeck™). Comparação da concentração de partículas em cada canal de fluorescência (F) e espalhamento (S). Os resultados da varredura de concentração para todos os canais estão dentro de uma faixa de aceitação de 5% em relação aos valores de concentração especificados pelo fabricante. A calibração de fluorescência incluída demonstra o resultado da concentração com uma calibração específica para o canal de fluorescência.
Determinação da concentração de EVs marcados com PAN e CD63-EGFP
Figura 6: Comparação entre a varredura de concentração e a medição em 11 posições para EVs marcados com PAN e EGFP. Para EVs marcados com CD63-EGFP, a varredura de concentração fornece resultados que confirmam exatamente as especificações dos EVs.
As vantagens da varredura de concentração também podem ser aplicadas a amostras reais, como EVs de tamanho desconhecido (Figura 6). EVs CD63-EGFP provenientes de células HEK293 (#700378/700377), disponíveis em nossa loja online, foram marcados com o Kit de Detecção F-NTA EV Tetraspanin da Particle Metrix 520 (#700388), seguindo as instruções do protocolo. Este kit contém três anticorpos direcionados aos marcadores de exossomos CD9, CD63 e CD81 (https://www.particle-metrix.com/products/f-nta-antibodies-f-nta-ev-tetraspanin-detection-kit?variant=50339633561930).
Com a nova tecnologia de varredura, a concentração da fração positiva para CD63-EGFP detectada no canal de fluorescência 488F500 apresenta resultados que coincidem exatamente com as especificações dos EVs (1,4 x 10¹⁰ partículas por ml). Em contraste, as medições em 11 posições diferentes apresentam uma concentração menor, pois são mais influenciadas pelo perfil do laser, configurações específicas da câmera e calibrações anteriores de fluorescência. No entanto, resultados similares poderiam ser obtidos com calibração prévia.
Esse fato é refletido também nos resultados da fração PAN marcada para tetraspaninas no canal de fluorescência 520F550, que inclui EVs positivos para CD9 e CD81 além do CD63, assim como nos resultados de espalhamento. Apesar das mesmas configurações de câmera, valores de concentração mais altos são obtidos com a varredura de concentração em comparação com a medição em 11 posições, tornando a nova técnica de medição uma aplicação mais sensível e versátil.
Conclusão
Nossa nova Tecnologia de Varredura de Concentração apresenta um método inovador para a determinação precisa da concentração de nanopartículas, combinando uma varredura volumétrica com a tecnologia NTA (Análise por Rastreamento de Partículas). Ao detectar partículas em todo o volume de medição, este método elimina a necessidade de calibração individual, que normalmente é requerida para amostras com variações em tamanho, material ou propriedades de fluorescência.
Comparado às medições convencionais de concentração por NTA, a varredura de concentração apresenta sensibilidade significativamente reduzida aos parâmetros de aquisição, como ganho da câmera, velocidade do obturador e combinação de laser/filtros utilizados. Essas características únicas permitem medições precisas da concentração de partículas de poliestireno em uma ampla faixa de tamanho, de 50 a 500 nm, sem a necessidade de calibração prévia.
Além disso, as medições de concentração realizadas com diferentes configurações de câmera produzem resultados consistentes, aumentando a estabilidade e a comparabilidade entre instrumentos. Isso simplifica o ajuste para novas configurações de medição e reduz a necessidade de ajustes manuais.
Os benefícios dessa tecnologia também se aplicam à medição de partículas fluorescentes, onde são utilizados diferentes lasers e filtros. Partículas marcadas com quatro fluoróforos diferentes foram medidas, apresentando concentrações idênticas tanto no modo dispersão quanto em todos os quatro canais de fluorescência, dentro de um intervalo de aceitação de 5%.
Por fim, a varredura de concentração mostrou-se ideal para a medição de vesículas extracelulares (EVs). O método livre de calibração entregou resultados robustos e confiáveis nas experiências com EVs marcadas com EGFP derivadas de células HEK293, que são amostras biológicas com tamanhos desconhecidos e fluorescência variável. Isso estabelece a Tecnologia de Varredura de Concentração como um padrão altamente versátil e confiável para análise de concentração de nanopartículas.
Referências
1. Zölls, S. et al. Particles in therapeutic protein formulations, Part 1: overview of analytical methods. Journal of pharmaceutical sciences 101, 914–935; 10.1002/jps.23001 (2012).
2. Gross, J., Sayle, S., Karow, A. R., Bakowsky, U. & Garidel, P. Nanoparticle tracking analysis of particle size and concentration detection in suspensions of polymer and protein samples: Influence of experimental and data evaluation parameters. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V 104, 30–41; 10.1016/j.ejpb.2016.04.013 (2016).
3. Patois, E., Capelle, M., Palais, C., Gurny, R. & Arvinte, T. Evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) in the characterization of therapeutic antibodies and seasonal influenza vaccines: pros and cons. Journal of Drug Delivery Science and Technology 22, 427–433; 10.1016/S1773-2247(12)50069-9 (2012).
4. Dragovic, R. A. et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine 7, 780–788; 10.1016/j.nano.2011.04.003 (2011).
5. Singh, S. K. et al. An industry perspective on the monitoring of subvisible particles as a quality attribute for protein therapeutics. Journal of pharmaceutical sciences 99, 3302–3321; 10.1002/jps.22097 (2010).
6. Huber, M. J. et al. Physicochemical characterization and quantification of nanoplastics: applicability, limitations and complementarity of batch and fractionation methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry 415, 3007–3031; 10.1007/s00216-023-04689-5 (2023).
7. Tian, Y., Tian, D., Peng, X. & Qiu, H. Critical parameters to standardize the size and concentration determination of nanomaterials by nanoparticle tracking analysis. International journal of pharmaceutics 656, 124097; 10.1016/j.ijpharm.2024.124097 (2024).
8. James, A. E. & Driskell, J. D. Monitoring gold nanoparticle conjugation and analysis of biomolecular binding with nanoparticle tracking analysis (NTA) and dynamic light scattering (DLS). The Analyst 138, 1212–1218; 10.1039/c2an36467k (2013).
9. Oliveira, E. M. de et al. Study of the polystyrene degradation in water using nanoparticle tracking analysis (NTA). Tecnol. Metal. Mater. Min. 20, e2347; 10.4322/2176-1523.20222347 (2023).
10. Filipe, V., Hawe, A. & Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical research.
11. Görgens, A. et al. Optimisation of imaging flow cytometry for the analysis of single extracellular vesicles by using fluorescence-tagged vesicles as biological reference material. Journal of extracellular vesicles 8, 1587567; 10.1080/20013078.2019.1587567 (2019).
12. Ribeiro, L. N. d. M., Couto, V. M., Fraceto, L. F. & Paula, E. de. Use of nanoparticle concentration as a tool to understand the structural properties of colloids. Scientific reports 8, 982; 10.1038/s41598-017-18573-7 (2018).
13. ISO/TS 24672:2023. Nanotechnologies – Guidance on the measurement of nanoparticle number concentration.
