A quantificação precisa e reprodutível de nanopartículas biológicas, como as Vesículas Extracelulares (EVs), continua sendo um desafio significativo em pesquisa biomédica e desenvolvimento de terapias. A Concentration Scanning Technology (CST), exclusiva do analisador de nanopartículas ZetaView® Evolution, oferece uma abordagem inovadora que elimina a necessidade de calibração para medições de concentração, permitindo comparabilidade direta entre diferentes tipos de amostras e canais de detecção (espalhamento de luz e fluorescência). Baseado em especificações técnicas do fabricante, validações publicadas e literatura independente, este artigo revisado detalha o princípio da CST, seus benefícios, limitações conhecidas e um protocolo prático otimizado para quantificação de EVs, visando estabelecer um padrão mais robusto e confiável para a comunidade científica.1. Introdução: O Desafio da Quantificação em Pesquisa com EVsAs Vesículas Extracelulares (EVs) — incluindo exossomos, microvesículas e outras nanopartículas biológicas — desempenham papéis cruciais em comunicação intercelular, descoberta de biomarcadores e desenvolvimento de terapias (ex.: drug delivery e vacinas). No entanto, a ausência de um método padrão-ouro para quantificação precisa e comparável representa uma barreira importante.Métodos tradicionais de isolamento, como ultracentrifugação diferencial, são frequentemente referidos como “gold standard” para purificação, mas sofrem com baixa reprodutibilidade, perda de partículas e potencial de agregação. Técnicas analíticas como a Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA) convencional e a citometria de fluxo de alta resolução dependem fortemente de calibrações com materiais de referência (ex.: esferas de poliestireno de tamanho conhecido) e são sensíveis a variações instrumentais, como configurações de câmera, intensidade do laser e profundidade de campo. Essa dependência dificulta comparações entre:

• Diferentes tipos de amostras (ex.: EVs de plasma vs. cultura celular);
• Canais de detecção (scatter vs. fluorescência);
• Instrumentos ou laboratórios distintos.

A Concentration Scanning Technology (CST) do ZetaView® Evolution foi desenvolvida para superar essas limitações, oferecendo medições de concentração livres de calibração, com alta robustez estatística e comparabilidade direta.2. Princípios Técnicos: Como a CST Supera Limitações ConvencionaisNa NTA convencional, a concentração é calculada contando partículas em um volume de detecção fixo e limitado, determinado pela profundidade de campo (sensível a configurações do instrumento e propriedades da amostra). Alterações na sensibilidade da câmera ou no perfil do laser podem alterar artificialmente o volume percebido, exigindo calibração frequente.A CST introduz uma abordagem diferente: em vez de medições discretas em posições fixas, o instrumento realiza um scan contínuo e rápido (~12 segundos) através de toda a célula de medição de quartzo, capturando milhares de partículas. Esse volume de medição é pré-determinado e fixo, tornando a concentração independente da profundidade de campo variável.Conforme a norma ISO 24672 (Nanotechnologies – Measurement of nanoparticle number concentration by nanoparticle tracking analysis), “a maior incerteza reside na profundidade de campo dependente da amostra e do instrumento”. A CST resolve isso ao eliminar a dependência desse parâmetro, fornecendo resultados estáveis em uma ampla faixa de configurações de câmera e para partículas de 50–500 nm, com concentrações de 10⁵ a 10⁹ partículas/mL.3. Validação da CST: Dados de Desempenho e ReprodutibilidadeValidações realizadas pelo fabricante e em estudos independentes demonstram:

• Precisão com padrões: Medições de esferas de poliestireno e sílica de 100 nm mantêm-se dentro do intervalo de confiança especificado, com alta comparabilidade entre diferentes instrumentos ZetaView® Evolution.
• Estabilidade em diferentes tamanhos: A CST mantém precisão em partículas de 50 a 500 nm, enquanto métodos convencionais calibrados para 100 nm tendem a superestimar concentrações de partículas maiores.
• Aplicação em EVs reais: Testes com EVs marcadas com anticorpos fluorescentes (ex.: tetraspaninas CD9/CD63/CD81) confirmam resultados consistentes e reprodutíveis, mesmo em amostras heterogêneas.

Limitações conhecidas: Embora a CST elimine calibração para concentração, amostras com alta viscosidade, agregação severa ou contaminantes ópticos (ex.: lipoproteínas) podem afetar a detecção. Bolhas na célula de quartzo ou drift térmico também requerem cuidados operacionais. Comparações com concorrentes (ex.: Malvern NanoSight NS300) mostram que a CST oferece maior robustez sem calibração, mas o tempo de limpeza entre amostras pode ser ligeiramente maior.4. Protocolo Aplicado Otimizado: Quantificação de EVs com o ZetaView® Evolution e CST

1. Preparação da amostra:
   • Diluir EVs purificadas em tampão PBS filtrado (0,22 µm) para concentração estimada entre 10⁶–10⁸ partículas/mL (ideal).
   • Realizar medição preliminar (quick scan) para ajustar diluição se necessário.
   • Centrifugar brevemente (ex.: 10.000 × g, 5 min) para remover agregados grandes.
2. Configuração no software ZetaSphere:
   • Selecionar perfil predefinido para “EVs” ou “Biological Samples”.
   • Ativar modo CST (Concentration Scan).
   • Configurar canais: scatter + fluorescência (se marcado com anticorpos).
3. Execução da medição:
   • Iniciar o scan automático (duração ~12 s por ciclo).
   • Realizar pelo menos 3–5 repetições para cálculo de média e CV (coeficiente de variação <10% é desejável).
   • Monitorar em tempo real: Live size and concentration statistics.
4. Análise e relatório:
   • Gerar relatório multiparâmetro: concentração absoluta (partículas/mL), distribuição de tamanho, potencial zeta (se medido) e estatísticas.
   • Exportar dados para análise estatística (ex.: GraphPad Prism).

Dicas de troubleshooting:

• Drift excessivo: Verificar alinhamento óptico e temperatura.
• Bolhas: Purgar célula com tampão antes da medição.
• Baixa contagem: Aumentar volume de amostra ou tempo de aquisição.

5. Conclusão: Um Avanço Significativo com Perspectivas FuturasA Concentration Scanning Technology (CST) do ZetaView® Evolution estabelece um avanço importante na nanocaracterização, oferecendo medições de concentração livres de calibração, reprodutíveis e diretamente comparáveis. Essa capacidade é valiosa para padronização em estudos pré-clínicos, controle de qualidade de terapias baseadas em EVs e ensaios interlaboratoriais.Embora a tecnologia não elimine todas as fontes de variabilidade em amostras biológicas complexas, ela reduz significativamente uma das principais incertezas da NTA convencional. Integrada às funcionalidades multiparamétricas do instrumento (tamanho, potencial zeta, F-NTA e C-NTA), a CST acelera a translação de pesquisas em EVs para aplicações clínicas, como biomarcadores, vacinas e entrega de fármacos.Referências Principais

• Particle Metrix. ZetaView® Evolution Brochure & CST Technical Note (2025).
• ISO 24672:2021 – Nanotechnologies – Measurement of nanoparticle number concentration by nanoparticle tracking analysis.
• Erdbrügger U, et al. (2021). MISEV Guidelines Update. Journal of Extracellular Vesicles.
• Estudos independentes recentes (2025–2026) em Nanoscale e Journal of Extracellular Vesicles validando CST em EVs de plasma e cultura celular.