Aplicação Técnica Validada: Nota AN2503 da Particle Metrix
A confiabilidade na quantificação de vesículas extracelulares (EVs) durante o processamento downstream tem sido um desafio constante. A Nota de Aplicação AN2503 , desenvolvida pela Particle Metrix em parceria com a Phoenestra GmbH , apresenta um estudo detalhado sobre balanço de massa e rendimento de partículas , usando a tecnologia ZetaView e o Kit de Detecção F-NTA para tetraspaninas.
O objetivo é demonstrar como processos otimizados podem melhorar a recuperação e a pureza das EVs, garantindo resultados confiáveis com ferramentas precisas de análise.
Desafios na Quantificação de Vesículas Extracelulares
A análise de vesículas extracelulares no contexto do processamento downstream pode ser prejudicada por:
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Forças de cisalhamento que afetam a estabilidade das partículas
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Formulações não otimizadas
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Presença de agregados oriundos de meios complexos como soro ou lisado de plaquetas humanas (hPL)
A utilização de meios livres de hPL e soro, combinada com métodos suaves de purificação, permite alcançar balanço de massa realista e alto rendimento em processos com células estromais mesenquimais (MSC).
Metodologia Baseada na Nota de Aplicação AN2503
O processo descrito na Nota AN2503 envolve as seguintes etapas principais:
Cultivo e Coleta Contínua
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Cultivo de MSC/TERT em modo de perfusão utilizando a tecnologia EVscale™
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Armazenamento do meio condicionado a -80°C até o processamento
Etapas do Processamento Downstream
1. Filtração em Profundidade
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Corte de 2–4 µm para remover precipitados
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Lavagem do filtro com buffer para maximizar recuperação
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Fator de concentração (CF): 0,8
2. Filtração Tangencial (TFF)
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Bomba de membrana de baixo cisalhamento
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Módulo de fibra oca com MWCO de 300 kDa
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Troca de buffer com seis diavolumes
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CF de 3–4 e taxa de troca superior a 98%
3. Concentração Final
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Filtração por centrifugação (MWCO: 100 kDa)
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CF final de aproximadamente 50
4. Centrifugação Final
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Remoção de agregados grandes antes da aliquotagem
Legenda:
Esquema do processo downstream com etapas de filtração, concentração e purificação aplicadas em EVs derivadas de MSC.
Análise por Nanoparticle Tracking Analysis (NTA e F-NTA)
As amostras coletadas antes e após cada etapa são analisadas com o sistema ZetaView® (Particle Metrix), utilizando:
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Modo de espalhamento de luz (NTA) : quantifica o número total de partículas
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Modo fluorescente (F-NTA) : com Kit de Detecção Tetraspanina para CD9, CD63 e CD81
Essa combinação permite um balanço de massa preciso e uma identificação seletiva de EVs verdadeiras.
Resultados do Estudo: Rendimento e Enriquecimento
Balanço de Massa nas Etapas do Processo
Conforme a Nota de Aplicação AN2503 , dois processos downstream independentes foram realizados. Os resultados mostram:
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Filtração em profundidade : rendimento de ~90%
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Filtração tangencial (TFF) : ~80%
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Concentração final : entre 65–85%
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Rendimento geral do processo : 50–60%
Legenda:
Gráfico com rendimento de partículas em cada etapa do processo downstream. Os dados mostram recuperação eficiente e balanço de massa confiável.
Concentração de Partículas Tetraspanina-Positivas
A análise F-NTA revelou um aumento na concentração de partículas tetraspanina-positivas ao longo do processo, indicando um enriquecimento progressivo das vesículas extracelulares autênticas .
Legenda:
Gráfico mostrando o aumento da proporção de partículas tetraspanina-positivas ao longo das etapas de filtração e concentração.
Conclusões Técnicas sobre o Balanço de Massa
A Nota de Aplicação AN2503 demonstrou que:
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A Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) é confiável para cálculo de balanço de massa de partículas em contextos isentos de soro e hPL
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A fluorescência com F-NTA permite validação da especificidade das vesículas
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A metodologia empregada assegura rendimento previsível e mensurável ao longo do processo
Aplicações Práticas do Estudo com ZetaView®
Este estudo oferece uma base sólida para:
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Monitoramento de processos downstream em EVs
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Otimização de métodos de purificação
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Implementação de estratégias de controle de qualidade
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Obtenção de dados consistentes de balanço de massa em vesículas extracelulares
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Baseado na Nota de Aplicação AN2503 - Colaboração entre Phoenestra GmbH e Particle Metrix GmbH
