Embora a contagem automatizada de células possa parecer uma aplicação simples, ela pode ser influenciada por diversas condições e variáveis, tanto da amostra quanto do próprio instrumento.
Com o analisador Vi-CELL BLU , introduzimos a capacidade de carregar 96 amostras em uma placa padrão e realizar isso como um único experimento. No entanto, isso exige aproximadamente 3 horas para completar toda a análise, o que pode não ser ideal, especialmente para tipos de células com baixa viabilidade ou que são suscetíveis à deterioração quando fora do incubador ou biorreator.
O carregador de placas também nos permite avaliar diferentes condições experimentais em uma única execução, proporcionando a oportunidade de testar uma variedade de parâmetros e critérios ao mesmo tempo.
Para demonstrar essas capacidades, realizamos uma análise com diferentes tipos de células e abordagens de preparação de amostras usando células padrão.
Análise de Contagem de Células
Culturas de células de CHO (Ovariano de Hamster Chinês), EL4 (Linha Celular de Linfócito T de Camundongo), SF9 (células de tecido ovariano de Spodoptera frugiperda ) e HELA foram utilizadas para avaliar os efeitos de durações longas de análise e diferentes condições de preparação de amostras em diversos tipos de células.
Impacto da Preparação de Amostras de Células CHO
A centrifugação e ressuspensão são métodos rotineiros para lavar e concentrar as células antes de replantá-las ou usá-las em outros experimentos. As células CHO geralmente são consideradas bastante resistentes, mas possuem requisitos de crescimento muito específicos e necessitam de meios especializados para garantir sua saúde ideal.
No experimento abaixo, as células foram centrifugadas a 1000 x g por 5 minutos, uma rotação relativamente suave, antes de serem ressuspensas em meio ou tampão para avaliar o impacto da preparação das células na saúde celular, se houver.
| Treatment | Concentration (M/mL) | Viability (%) | Diameter (µm) |
|---|---|---|---|
| Untreated | 4.83 | 94.30 | 16.12 |
| 1 Spin, resuspend in media | 5.05 | 94.48 | 16.17 |
| 1 Spin, resuspend in PBS | 4.70 | 65.69 | 14.17 |
| 2 Spin, resuspend in PBS | 4.45 | 53.77 | 13.99a |
Análise do Ciclo de Mistura das Células EL4
Resultados
| Mix Cycles | Cell Count | Viable Cell Count | Concentration (M/mL) | Viability (%) | Diameter (µm) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 4648 | 2837 | 1.72 | 61.06 | 11.34 |
| 3 | 4637 | 2715 | 1.72 | 58.54 | 11.34 |
| 5 | 4660 | 2582 | 1.73 | 55.69 | 11.34 |
| 7 | 4660 | 2448 | 1.73 | 52.53 | 11.32 |
Figura 3. Impacto dos Ciclos de Mistura nas Células EL4
Células SF9 de Inseto
Figura 4. Viabilidade e Diâmetro Médio das Células SF9 ao Longo do Tempo; Nenhuma Mudança Significativa Observada Durante o Experimento.
Culturas de Células HELA
Ao visualizar as imagens adquiridas, observa-se um número crescente de células que parecem estar inchando ou formando blebbing , junto com um grande número de vesículas não celulares. Embora estas últimas geralmente não impactem a contagem celular , dependendo das configurações do perfil celular , elas podem ser contadas como células pequenas. O efeito de inchaço faz com que o diâmetro médio das células aumente quase 10% durante as 3 horas necessárias para rodar a placa, o que pode fazer com que algumas células menores, logo abaixo do limite inferior do diâmetro, sejam incluídas na contagem de células.
Conclusões
Recomenda-se que, antes de realizar a execução de uma cultura celular em uma placa completa, seja feita uma avaliação inicial para determinar a robustez das células envolvidas e sua capacidade de tolerar os métodos de preparação de amostras e exposição prolongada fora do ambiente do incubador. Mesmo células geneticamente modificadas, como as células CHO ou as células HELA imortais, que geralmente são selecionadas para serem bastante duráveis, podem ser afetadas por estresse ou condições específicas de preparação da amostra.
