Cultivo Fototrófico de Chlorella vulgaris no Microbioreator BioLector XT

Os avanços na engenharia de bioprocessos têm impulsionado a pesquisa com microalgas, como Chlorella vulgaris , para diversas aplicações, incluindo produção de biocombustíveis, sequestro de CO₂ e biorremediação ambiental . 

Este artigo explora os desafios e soluções para o cultivo eficiente de Chlorella vulgaris, destacando o uso do microbioreator BioLector XT, equipado com o módulo de iluminação LAM (Light Array Module), que permite o controle preciso da iluminação e monitoramento contínuo de variáveis essenciais como biomassa, clorofila e pH. Além disso, são apresentados métodos de calibração de sensores ópticos e estratégias de cultivo fotoautotrófico, visando a maximização da produtividade da biomassa.

Desafios para a Aplicação Industrial de Microalgas

O uso de microalgas como fábricas celulares microbianas oferece soluções para desafios globais, como a crise alimentar e energética ². No entanto, para que sejam viáveis em escala industrial, é essencial a otimização das condições de cultivo , a adaptação de biorrefinarias e a implementação de estratégias avançadas de triagem e engenharia de linhagens ³.

Dentre as abordagens promissoras, destaca-se a redução do tamanho da antena de clorofila , que pode aumentar significativamente a eficiência na conversão de energia solar em biomassa , maximizando o rendimento dos cultivos fototróficos⁴.

Triagem e Otimização de Cultivos de Microalgas

A triagem eficiente de linhagens e a otimização das condições de cultivo são etapas fundamentais para o desenvolvimento de processos escaláveis. Dispositivos baseados em microrreservatórios são amplamente utilizados para cultivo de células microbianas e de mamíferos , permitindo experimentos em alto rendimento ⁵.

Tais sistemas já demonstraram grande potencial no desenvolvimento de bioprocessos para microalgas heterotróficas , acelerando a pesquisa e a otimização de parâmetros críticos⁶. No entanto, cultivos autotróficos e mixotróficos exigem microfotobiorreatores (µPBRs) para a determinação precisa das condições ideais de crescimento . Ainda assim, os sistemas convencionais carecem de avanços, especialmente no que se refere ao controle preciso da iluminação ⁷.

Configuração do BioLector XT para o Cultivo Fototrófico

Para este estudo, o microbioreator BioLector XT foi equipado com um módulo de iluminação avançado , permitindo cultivos fototróficos paralelos em até 48 microrreservatórios . Para garantir um monitoramento contínuo e preciso, foram desenvolvidos módulos de filtro especializados , possibilitando a medição online e não invasiva de variáveis essenciais, como biomassa, concentração de clorofila e pH .

O sistema inclui o Light Array Module (LAM) , projetado para oferecer regimes de iluminação ajustáveis dentro dos espectros fotossintéticos relevantes. Com 16 tipos distintos de LEDs , cada um ajustável individualmente, o LAM proporciona uma flexibilidade espectral otimizada , atingindo irradiâncias máximas próximas de 4000 μmol/m²/s .

Características e Aplicações da Chlorella vulgaris

A microalga Chlorella vulgaris pode crescer sob condições fototróficas, heterotróficas e mixotróficas ¹³. Atualmente, é um dos gêneros de microalgas mais comercializados no mundo , com uma produção anual estimada em 5.000 toneladas de biomassa ¹⁴.

Essa espécie apresenta altas taxas de crescimento sob diferentes condições de cultivo e tem sido amplamente estudada devido ao seu potencial na produção de compostos bioquímicos com aplicações industriais¹⁵. Seu elevado teor proteico , com um perfil de aminoácidos alinhado às recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS) para nutrição humana, torna-a um ingrediente promissor para os setores alimentício e de nutrição animal ¹⁵.

Além disso, sob condições de estresse , C. vulgaris acumula ácidos graxos de cadeia C16 e C18¹⁶,¹⁷, ampliando seu potencial para a produção de biocombustíveis , especialmente em processos associados ao tratamento de águas residuais ¹⁵.

Figura 1 - O microbioreator BioLector XT com o LAM.

Cultivo Fotoautotrófico no BioLector XT

Para demonstrar a viabilidade do cultivo fotoautotrófico de C. vulgaris , este estudo utilizou o microbioreator BioLector XT , equipado com o módulo de iluminação LAM (Light Array Module) . Além disso, foram desenvolvidos e validados módulos de filtro especializados para o monitoramento online de parâmetros essenciais do cultivo.

Figura 2 - Chlorella vulgaris cultivada fotoautotróficamente no microbioreator BioLector XT.

Métodos

Desenvolvimento dos Módulos de Filtro

Diversos módulos de filtro foram projetados e testados para o monitoramento online de parâmetros críticos no cultivo fototrófico.

Medição de Biomassa

Para a determinação da biomassa com dispersão de luz¹⁸, foram desenvolvidos módulos de filtro ajustados para operar fora do espectro de absorção da clorofila (>700 nm), evitando interferências pigmentares ¹⁹. Esses módulos foram calibrados utilizando uma série de diluição de Chlorella vulgaris .

Medição do Teor de Clorofila

A fluorescência da clorofila foi utilizada para quantificar concentrações de clorofila em tempo real . Para isso, padrões de clorofila a e b (Sigma-Aldrich) foram dissolvidos em DMSO, e vários módulos de filtro foram testados com séries de diluição de clorofila a e b . Além disso, foi realizada uma calibração da fluorescência da clorofila em relação à biomassa .

Medição do pH

A medição de pH por optodes ²⁰ não pode ser aplicada sob iluminação contínua , devido à sua susceptibilidade ao fotobranqueamento . Como alternativa, utilizou-se o indicador fluorescente solúvel 8-hidroxipireno-1,3,6-trissulfônico trisódico (HPTS) para determinação óptica do pH²¹,²².

Para essa abordagem, dois módulos foram projetados, pois a determinação do pH via HPTS requer medição ratiométrica .

A fluorescência do HPTS em 520 nm varia de acordo com o pH, sendo excitada em 405 e 455 nm , respectivamente. A relação de intensidade (IR) (Eq. 1) é estável no intervalo de pH 0 a 14 ²¹, mas os valores exatos só podem ser calculados após calibração prévia ²². O ajuste dos resultados da calibração à equação de Boltzmann permite a determinação dos parâmetros pH₀, dpH, IR,min e IR,max (Eq. 2)²³.

Com os módulos de filtro projetados , foram geradas curvas de calibração para avaliar o potencial da determinação de pH via HPTS no microbioreator BioLector XT . Além disso, a susceptibilidade dessa técnica ao fotobranqueamento foi testada sob condições típicas de cultivo fototrófico .

Microalga Chlorella vulgaris

A cepa axênica de Chlorella vulgaris utilizada no estudo foi obtida da Culture Collection of Algae da Universidade de Göttingen (SAG Strain Number 211-11b).

Meio de Cultivo

As culturas foram cultivadas em um meio modificado Bold’s Basal Medium (enBBM) , ajustado para um pH de 6,5 ²⁴-²⁷.

A composição do meio incluiu:

• 9,76 g/L MES buffer

• 1,5 g/L NaNO₃

• 0,6 g/L K₂HPO₄

• 1,4 g/L KH₂PO₄

• 187,5 mg/L MgSO₄ · 7 H₂O

• 6,25 mg/L NaCl

• 125 mg/L CaCl₂ · 2 H₂O

• 9,96 mg/L FeSO₄ · 7 H₂O

• 3,68 mg/L H₂SO₄

• 100 mg/L Na₂EDTA · 2 H₂O

• 62 mg/L KOH

• 10 mg/L penicilina G sódica

• 20 mL/L solução de oligoelementos

A solução de oligoelementos foi composta por:

• 17,64 mg/L ZnSO₄ · 7 H₂O

• 2,88 mg/L MnCl₂ · 4 H₂O

• 2,4 mg/L Na₂MoO₄ · 2 H₂O

• 3,14 mg/L CuSO₄ · 5 H₂O

• 0,94 mg/L CoSO₄ · 7 H₂O

• 22,8 mg/L H₃BO₃

Para os cultivos no microbioreator BioLector XT , foi adicionada ao meio uma solução estoque de HPTS , resultando em uma concentração final de 0,1 mg/L .

Cultivo em Frascos Agitados

Os pré-cultivos foram mantidos em frascos agitados , incubados a 25 °C e 180 rpm , com um diâmetro de agitação de 50 mm .

Para garantir o crescimento fototrófico , foi instalado um módulo de LED em uma das laterais da câmara de incubação, enquanto tampões de algodão permitiram a troca gasosa entre o meio e a atmosfera.

O módulo continha oito tiras de LED (LUMITRONIX LED-Technik GmbH) dispostas em paralelo . A irradiância foi ajustada para 200 μmol/m²/s , igualando a irradiância usada no microbioreator BioLector XT .

Cultivo no Microbioreator BioLector XT

O cultivo fototrófico foi realizado em microplacas Flowerplate (M2P-MTP-48-B, m2p-labs , agora parte da Beckman Coulter Life Sciences )²⁸, com uma concentração inicial de 5,5 × 10⁶ células/mL e volume de enchimento de 1 mL .

A microplaca foi selada com uma folha de vedação permeável a gases (MTP-F-GPRS-48-10), permitindo a troca de CO₂ e O₂ durante a fotossíntese .

O módulo de iluminação foi ajustado para fornecer um espectro semelhante ao solar , variando de 400 a 700 nm , com uma densidade de fluxo de fótons de aproximadamente 200 μmol/m²/s ( Figura 3 ).

Figura 3 - Espectro de iluminação e irradiância ajustados durante o cultivo.

Os parâmetros de cultivo foram estabelecidos como:

• Velocidade de agitação: 800 rpm

• Temperatura: 25 °C

• Umidade relativa: 85%

• Taxa de aeração: 10 mL/min

• Composição do gás: Mistura de ar com 2% de CO₂

Calibração dos módulos de filtro

Biomassa

Os filtros de biomassa desenvolvidos a 730, 750 e 850 nm apresentaram excelentes resultados de calibração em um intervalo de 0,3 ≤ OD750 ≤ 25, conforme demonstrado na Figura 3 para o módulo de 730 nm. Além disso, nenhuma interferência da clorofila foi detectada nos padrões de clorofila a e b.

Figura 4 - Calibração de um módulo de filtro de luz espalhada a 730 nm contra uma série de diluições de C. vulgaris .

Clorofila

Os resultados da calibração da clorofila revelaram que os módulos de filtro projetados permitiram a detecção separada e simultânea da clorofila a e b (Figura 5).

Figura 5 - Calibração dos módulos de filtro de fluorescência da clorofila contra séries de diluição de clorofila a (preto) e clorofila b (vermelho).

A fluorescência da clorofila é frequentemente utilizada para a determinação de biomassa em culturas fototróficas. Assim, foi realizada uma calibração com uma série de biomassa diluída, e uma excelente resolução foi observada em baixas concentrações de biomassa quando um ajuste exponencial decrescente foi aplicado (Figura 6).

Figura 6 - Calibração do módulo de filtro de clorofila (λex = 450 nm; λem = 700 nm) contra biomassa até OD750 = 2.

Os resultados da calibração confirmam a aplicabilidade dos filtros de fluorescência de clorofila para a determinação precisa da concentração de biomassa, especialmente em baixas concentrações.

pH

Os módulos de filtro de pH foram calibrados a 25, 30, 35 e 40 °C com soluções tampão de pH 5 a 10 (Merck, Darmstadt, DE), contendo 0,1 mg/L de HPTS. Os excelentes resultados de calibração (Figura 7) confirmam que a configuração proposta pode ser usada para uma determinação precisa e online do pH.

Figura 7 - Calibração da razão de intensidade IR contra o pH, ajustada à equação de Boltzmann.

Para garantir a insensibilidade do método proposto à fotodegradação, foi realizado um experimento no microbioreator BioLector XT sob condições típicas de cultivo, com 200 μmol/m²/s em enBBM sem inóculo (Figura 8).

Figura 8 - Determinação óptica do pH com HPTS em poços triplicados sob condições de cultivo.

A concentração aumentada de CO₂ acidifica rapidamente o meio (~0,05 pH) no início do experimento, mas, posteriormente, os valores medidos permanecem constantes por pelo menos 130 horas (Figura 8). Isso comprova que é possível uma determinação precisa e estável do pH por vários dias sob condições de cultivo e, especialmente, sob iluminação contínua com HPTS.

Cultivo fototrófico paralelo no microbioreator BioLector XT

Em seguida, foi iniciado um cultivo de longo prazo, monitorado online com quatro dos módulos de filtro apresentados: o módulo de luz espalhada a 730 nm, o módulo de fluorescência de clorofila (λex = 450 nm; λem = 700 nm) e ambos os módulos de HPTS para determinação ratiométrica do pH (Figura 9).

Figura 9 - Luz espalhada, clorofila e pH durante um cultivo de 16 dias no microbioreator BioLector XT em combinação com um módulo de iluminação.

A Figura 9 mostra um aumento contínuo da concentração de biomassa por aproximadamente 16 dias, até que o fornecimento de CO₂ foi interrompido. Cinco fases de crescimento distintas são observadas: iniciando com uma fase lag e uma fase de crescimento exponencial (I.), seguida por três taxas de crescimento linear distintas (II. a IV.), e uma fase de morte (V.) após a depleção de CO₂.

O curso do pH e do sinal da clorofila correlaciona-se com as fases de crescimento observadas. O coeficiente médio de variação do sinal de luz espalhada ao longo do experimento foi de 5,2 %, permitindo cultivos fototróficos paralelos na configuração proposta.

Amostras offline confirmaram a precisão dos sinais online. Após 235 horas – quando foi observada um aumento no pH devido a uma breve exposição ao CO₂ atmosférico – os valores offline de OD750 foram de 40 e o pH offline foi de 7,3, correlacionando-se bem com o pH online de 7,2. No final do experimento, os valores offline de OD750 estavam em torno de 60, indicando um crescimento forte durante o experimento e levando a altas concentrações de biomassa.

Conclusão

Expansão das capacidades do BioLector XT

A adição do Light Array Module representa um avanço significativo para os instrumentos BioLector. Esta aplicação demonstrou vários módulos de filtro capazes de monitorar com precisão os principais parâmetros do cultivo fototrófico: concentração de biomassa, conteúdo de clorofila e pH.

A excelente resolução para a determinação de biomassa em baixas concentrações, obtida com o módulo de filtro de fluorescência de clorofila, complementa a medição de luz espalhada, que é mais precisa em densidades celulares suficientemente altas¹⁸. Além disso, a determinação do pH baseada em HPTS se mostrou uma excelente alternativa às medições com optodos, mesmo sob iluminação contínua.

Cultivo de longo prazo e otimização de parâmetros

O cultivo de longo prazo com Chlorella vulgaris confirmou o potencial do sistema como um fotobiorreator paralelo de alto rendimento em escala microlitro. Além disso, os módulos de filtro desenvolvidos forneceram informações online sobre o crescimento das culturas e revelaram diversas fases de crescimento distintas. Esses resultados oferecem uma plataforma valiosa para a otimização dos cultivos fototróficos de diversas maneiras e aplicações.

O design do módulo de iluminação permite configurar uma ampla faixa espectral e de irradiância sob diferentes regimes de iluminação. Isso possibilita a identificação de condições ideais de iluminação, fator amplamente relatado como influente no crescimento das algas¹²,³¹⁻³⁵.

Outros parâmetros críticos podem ser ajustados para otimizar os cultivos fototróficos, incluindo:

• Taxa de fluxo e composição do gás: alterações na atmosfera do microbioreator BioLector XT, como enriquecimento com CO₂, resultam em maiores concentrações de biomassa¹⁵,³³.

• Temperatura³⁶,³⁷.

• pH¹⁵,³⁴.

• Salinidade³⁸.

• Fonte de carbono³⁹⁻⁴¹.

• Fonte de nitrogênio³³,³⁹.

• Composição do meio de cultivo⁴².

O BioLector XT permite a otimização de todos esses fatores.

Potencial futuro e aplicações avançadas

O cultivo fed-batch tem sido proposto como uma estratégia para aumentar a produtividade lipídica⁴³. Além disso, o potencial da engenharia genética em algas ainda é pouco explorado devido a restrições regulatórias, mas poderia resultar em:

• Taxas de crescimento e densidades celulares mais altas.

• Maior taxa de produção ou título.

• Maior robustez.

• Maior eficiência na conversão solar-biomassa e produtividade fotossintética¹,⁸,⁴⁴,⁴⁵.

Todos esses fatores podem ser investigados e otimizados utilizando a combinação proposta do microbioreator BioLector XT e o Light Array Module, acelerando a pesquisa e contribuindo para o aproveitamento do potencial das algas.

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