Screening de pH + análise de estado celular: uma abordagem integrada para aumentar rendimento proteico em leveduras

Application Note Beckman Coulter resumida e contextualizada para rotina laboratorial no Brasil.

Quando falamos em culturas de leveduras para expressão recombinante , o ajuste do pH costuma parecer um detalhe. Mas, em bioprocessos, pequenos detalhes viram diferenças grandes — tanto no tempo para início da expressão , quanto no rendimento final por volume .

Para reduzir o gargalo de otimização, combinamos:

• BioLector® Microbioreactor — screening de pH em 32 condições simultâneas com monitoramento online;
• Multisizer™ 4e — distribuição real de tamanhos celulares para revelar o estado fisiológico da cultura.

BioLector® Microbioreactor

Monitoramento contínuo de pH, biomassa, O₂ e fluorescência. Permite até 32 cultivos em paralelo para otimização rápida de condições de expressão.

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Multisizer™ 4e Coulter Counter

Mede cada célula individualmente por impedância, revelando a distribuição real de tamanhos e o estado fisiológico da cultura.

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Como o screening foi executado

• Microplaca FlowerPlate® MF32-BOH3
• 800 µL por poço
• Temperatura: 30 °C
• Agitação: 1200 rpm
• Meio: YNB + glicose + (NH₄)₂SO₄
• pH ajustado via chip microfluídico integrado (3 M NaOH / 3 M HCl)
• Leitura contínua de pH, biomassa, O₂ dissolvido e fluorescência (GFP)

Resultados: o pH realmente muda o jogo

¹ GFP apresenta perda de fluorescência abaixo de pH 4,5 (Campbell, 2001). Dados completos disponíveis na Application Note original.

Veja em tempo real como o pH controla a expressão: pH 4,0 dispara a GFP em 12 horas, enquanto pH 6,5 mal inicia após 50h.

Curvas de três cultivos representativos (pH 4, 5 e 6) mostram o impacto direto do pH no início e na taxa de produção de GFP — tudo medido online, sem coleta manual.

E a prova final vem do Space-Time-Yield (STY): pH 4,0 entrega o maior rendimento por litro por hora — mesmo com apenas 25 mM de buffer fosfato.

Gráfico de barras confirma: pH 4,0 lidera com ~11 a.u./L·h, seguido por pH 4,5 e 5,0. A partir de pH 5,5, o STY cai progressivamente — pH 6,5 rende apenas ~60% do máximo.

Interpretação prática: pH mais baixo = expressão mais cedo e mais forte. Porém, requer atenção à estabilidade da proteína alvo , caso não seja GFP.

Do rendimento ao entendimento fisiológico: onde entra o Multisizer 4e

OD600 mede turbidez (média), não fisiologia. O Multisizer™ 4e mede cada célula por impedância elétrica:

• Pico modal de tamanho celular: 2,8 a 7,0 µm durante fase log;
• Células chegando a ~13 µm em condições de estresse / transição para estacionária.

Mas como o Multisizer™ 4e vê cada célula individualmente? Aqui está o raw data: milhares de pulsos elétricos gerados por células passando pelo orifício — cada ponto é uma célula real.

A caixa tracejada destaca a região selecionada para análise detalhada (2,8 a 7 µm). Tecnologia DPP armazena todos os pulsos sem perda — permitindo reanálise infinita.

Por que isso reduz tempo de otimização na prática

• 32 condições em 48 h (em vez de semanas em frascos agitados)
• Zero coleta manual → elimina viés de pipetagem
• +45% de produtividade volumétrica em pH 4,0
• Monitoramento real → não apenas endpoints
• Entendimento fisiológico , não apenas densitometria

FAQ - 7 Perguntas Respondidas pelo Application Note

1. Por que leveduras como H. polymorpha são populares para produção de proteínas recombinantes?

Resposta: São baratas, crescem rápido, fáceis de manipular geneticamente e realizam a maioria das modificações pós-traducionais necessárias para proteínas biologicamente ativas. (Introdução)

2. Quais parâmetros o BioLector® monitora online, sem parar o cultivo?

Resposta: pH, biomassa, saturação de oxigênio, velocidade de agitação e intensidade de fluorescência — tudo sem amostragem manual. (Seção: Monitoring Optimal Cell Culture Conditions)

3. Como foram ajustados os 32 valores de pH diferentes no experimento?

Resposta: Usando chip microfluídico na placa de 32 poços, com NaOH 3 M e HCl 3 M como agentes ajustadores. (Métodos – BioLector)

4. O que acontece com a expressão de GFP em pH mais baixo?

Resposta: Quanto menor o pH, mais cedo inicia a expressão e maior a taxa de produção (melhor em pH 4,0). Porém, GFP é instável em pH baixo — comparação apenas qualitativa. (Resultados)

5. O que é Space-Time Yield (STY) e o que o estudo mostrou?

Resposta: STY é a produtividade volumétrica ao longo do tempo. O estudo confirmou maior produção de GFP em valores de pH mais baixos. (Figura 3)

6. Qual a faixa de tamanho das células de levedura medida pelo Multisizer™ 4e?

Resposta: De 2 a 13 μm. Exemplo de histograma: 2,8 a 7 μm na fase log. (Figuras 4 e 5)

7. Como o Multisizer™ 4e mede células e por que é melhor que OD600?

Resposta: Pelo princípio de Coulter: cada célula passa por um orifício e gera um pulso proporcional ao seu volume. Detecta 1 célula em 1 mL (DPP). OD600 só mede turbidez média — não mostra distribuição real. (Seção: Monitoring Cell Growth)